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(無題) 削除/引用 No.11805-30 - 2023/09/29 (金) 13:12:16 - 0324 皆様 色々とご助言をいただき、ありがとうございます。 プライマーを再設計するのが一番早いと思いますので、そのようにいたします。 頂いたご指摘でかなり勉強になりました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.11805-29 - 2023/09/29 (金) 12:43:13 - おお 指摘されると、やはりコンタミのような気がしてきました。rtのテンプレートより増幅されたアンプリコンの方が遥かかかりがいいのでctの差で推しはかるには無理があると思えるからです。

(無題) 削除/引用 No.11805-28 - 2023/09/29 (金) 12:14:16 - G25 あれこれこねくり回して考えておられるようですが、 単純に標的DNAのコンタミネーションだということは明らかなように思います。 >コンタミ疑いのため、 >・ピペット洗浄 >・実験者の交替 >を行いました。 で消えなかったからといってコンタミネーションを否定するものではないでしょう。例えば、ベンチ、実験室を変えるとか、クリンベンチで作業するとかは？ おそらく内部標準として同じハウスキーピング遺伝子を何度もPCRしてきたと思いますが、その産物が濃厚な汚染源になりえます。同じ研究室でよくPCRする標的産物が汚染源になって実験室環境が漫然と汚染し、negative ctrでも増えてくるっていうのはありがちです。そういうPCR産物による汚染を避けるために、PCR検査をする施設とか、NGSをルーチンでやる施設なんかでは、作業ごとに部屋を分けたりクリンベンチを分けたりしていますね。 あとできそうなのは、 1. 焼畑農業みたいに、コンタミネーションが疑われたら内部標準の標的を変えて行く 2. PCRにはdUTP入りのdNTPsを使用、PCRの前処理でウラシルDNAグリコシラーゼ処理をする。

(無題) 削除/引用 No.11805-27 - 2023/09/29 (金) 10:36:23 - T8 "普通"のPCRとは今回の条件とは違うということですので、 今回と同じ条件でNTCのみを行ってみるのが良いかと思います。 こういう確認実験は条件をできるだけ揃えて、 その差異で原因を絞っていきます。 例えば、774R様のご指摘は今のところ否定できていませんが、 上記の実験を行えば否定できます。 （昔出なかったが、今出ている可能性としては直近でコンタミさせていればあり得ます）

(無題) 削除/引用 No.11805-26 - 2023/09/29 (金) 03:55:47 - おお >[Re:25] 0324さんは書きました : > おお様 > プライマーは3年前と配列は同じですが、1か月前に新調しました。 精製のグレードとかおんなじですか？同じメーカーからのオーダーなら一度メーカーに事情を話してみる手もいいかもしれません。いろいろな人の話の中で、プライマーの配列が注文したものと違ったとかいう人がいます。けれどたぶんその人は配列を確認して言っているように思えないので、手技的なものかほかの原因がありそうに私は思っていますが、そんなことが起こっているかは置いといて、クレーマーみたいなやり方じゃなくて相談という形で話してみてもいいかもしれません。最小スケールで再合成とかやってくれたら何らかの結果は得られるかもしれません。 バクテリアなどのゲノムのコンタミは結構昔に問題になって、やはりバクテリアの実験する人にはクリティカルなので結構改善されているとは思うけど、商品によってはそういう実験には使えないものもあるかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.11805-25 - 2023/09/28 (木) 15:06:38 - 0324 774R様 そんなことは考えもしませんでした.. そうであるとすると、なおさらプライマーの再設計が必須です。 しかし、3年前は出ていないものが、今回は出るというのも腑に落ちないところです。 おお様 プライマーは3年前と配列は同じですが、1か月前に新調しました。

(無題) 削除/引用 No.11805-24 - 2023/09/28 (木) 14:36:51 - おお プライマーを3年前に買ったものを使っていたなら、プライマーの劣化かもしれない。

(無題) 削除/引用 No.11805-23 - 2023/09/28 (木) 14:32:16 - 774R 残るはqPCR用に用いる試薬に鋳型になりうるものが入っている可能性が出てきました。 特にPCR酵素は菌から精製してきたものなので、DNAが混入している可能性があります。

(無題) 削除/引用 No.11805-22 - 2023/09/28 (木) 12:57:36 - 0324 皆様 ありがとうございます。 プライマーの配列は確認しましたが間違えておりませんでした。また、3年前に同じプライマーを使用してうまくいっていました（NTCは増幅せず、鋳型有りのみ増幅）。さらに、問題が起こってから再注文しているので、プライマー原液のコンタミも考えにくいです。 3年前にうまくいっていた試薬でも試しましたが、やはりNTCに出てきました。今回は3年前に使っていたものより、バージョンアップした試薬を使っていて、増幅しにくいサンプルにも使える試薬でした。そのため目的物ではないものが増幅されている可能性を考えて、元々使っていた試薬を試しました。 その他、ご指摘事項を回答します。 ・普通のPCRというのは、qPCRと同じ条件ではありません。PCR用の酵素とその条件です。 ・NTCのCq値は鋳型を5段階希釈した最も薄い濃度とほぼ同じ値となります。 ・2か所のピークに関して、ターゲットの方がサイズが小さく低い温度で出ています。この解釈自体は正しいのですね。ハウスキーピングの生成物が目的物でないことは否定できませんが。 ・12と17のレスについて 17のとおりです。12は表現が良くありませんでした。各ウェルのピークはいずれも一つです。96ウェル分を表示すると2つのピークが見えて、1方ピークはターゲット群、もう一方はハウスキーピング群ということです。

(無題) 削除/引用 No.11805-21 - 2023/09/28 (木) 11:01:29 - 通りすがり >[Re:17] 0324さんは書きました : > 一つのウェルには1組のプライマーペアです。96ウェルで半分（48ウェル）をターゲット遺伝子、残り半分をハウスキーピング遺伝子にしております。 >[Re:12] 0324さんは書きました : > ピークが2つというのは、全てのウェル（ハウスキーピングも、ターゲットも両方含めて）のピークが2つということです。 > ハウスキーピング遺伝子サンプル群のピークとターゲット遺伝子のサンプル群のピークです。ハウスキーピング遺伝子のNTCのピークはハウスキーピング遺伝子サンプル群のピークと重なっております。 どういうこと…? 「全てのウェルでピークが2つ(ハウスキーピングとターゲット)」と読んでいましたが、ハウスキーピングとターゲットを異なるウェルで反応させているなら12のレスはどういう意味?

(無題) 削除/引用 No.11805-20 - 2023/09/28 (木) 06:02:59 - T8 >普通のPCRも実施しました。鋳型なしとプライマー片方なしのコントロールを作りましたが、いずれもバンドはでませんでした。 "普通の"PCRっていうのは今回と同じ条件で、その実験の時には鋳型なし（ほかの条件にも鋳型を使用しなかった）でやったということですよね？ 個人的にはプライマー溶液への鋳型の混入を疑ったんですけど、 これでバンドが出ないとなると、これまでの結果から、 鋳型を使用した実験の際にしかNTCが増幅していないので、操作によるコンタミを疑いたくなりますが、うーん・・・ NTCは5段階希釈の鋳型の一番薄い濃度より薄いですか？ それとも毎回どの段階の鋳型と同程度になるかは異なっていますか？ ＞ところで、先に質問しました、ピークが2か所の解釈は間違っていないでしょうか。 ターゲットサンプル群のピークとハウスキーピング群のピークで2つの温度にピークが出ています。 それで大丈夫です。今回の場合、ターゲットの方が小さいので、基本的にはターゲットの方が低い温度にピークがあるはずです。 ただし、シングルピークだとしてもそれが目的のサイズとは違うものを"単一"に増やしている可能性があるので、初めて使うプライマーは電気泳動でサイズ確認もするのが無難です。 それ以降は、その時と同じ温度にシングルピークが出ているならばOKです。

(無題) 削除/引用 No.11805-19 - 2023/09/28 (木) 02:50:48 - おお あとまれにあるんだけど、そのプライマーの配列間違えてないですか？論文などにあったものをそのままコピーしたけど、論文で書かれた配列が間違っていたとかまあまあ見つけます。あとはどういうわけかリバーズプライマーがフォワードと同じ向きに走る、というかリバースコンプリメントにしてなかったりとか、配列はリバースしているけど３’から５’の向きで書かれているものをそのまま注文してしまったとか。 ま、作り直すならそういうミスがあっても新たに作ったもので間違えがなければ関係ないのですが。

(無題) 削除/引用 No.11805-18 - 2023/09/28 (木) 02:16:42 - おお まず、メルティングカーブのピークの温度が同じなら同じアンプリコンだろうというのは乱暴です。ただ、ワークするであろうプライマーセットにおいてダイマーやノンスぺがあるかを確認するには使われている手法ではあります。 たとえば５０ベースのダブルストランドがあって、ランダムに考えると４の５０乗の組み合わせがあるのをメルティングカーブで見分けることができますか？ あと電気泳動のサイズだけど、たとえば１３７と１４０を見分けられますか？ほんとに目的のアンプリコンであるのを確認するにはシーケンスが確実だろうけど、制限酵素を使って理屈道理に切れるかを見るのもできることだと思います。だたし短いし、切れにくい可能性もあるのでプラスミドをきる感覚では結果がわからなくなるかもしれません。 また、鋳型ありでのＰＣＲでも目的のアンプリコンが増えてない可能性もあるのではないでしょうか。サンプルからのいろいろな持ち込みでノンスぺの出具合が促進されただけかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11805-17 - 2023/09/28 (木) 01:09:02 - 0324 あの様 ありがとうございます。 一つのウェルには1組のプライマーペアです。96ウェルで半分（48ウェル）をターゲット遺伝子、残り半分をハウスキーピング遺伝子にしております。

(無題) 削除/引用 No.11805-16 - 2023/09/28 (木) 00:55:07 - あの 一つのウェルの中で、2組のプライマーペアを入れて反応させているのですよね。 そういう方法もあるとは思いますが、一つのウェルの中には、1組のプライマーペアだけ入れるようにした方が良さそうです。 理由は、四つのプライマー同士が、何らかの長い産物を作る反応が、鋳型無しのNTCウェルだけで起きるかもしれないからです。

(無題) 削除/引用 No.11805-15 - 2023/09/27 (水) 23:47:21 - 0324 皆様 ターゲットのサイズは90bpでハウスキーピングは140bpです。ハウスキーピング鋳型ありもNTC（鋳型なし）もバンドはターゲットよりも少し上で出ているので、サイズは間違いないと思います。 ターゲットのNTCでCq値35に出たものがあり一緒に泳動しましたが、それは90よりも低い位置にかなりうっすら広めのバンドが出たので、ダイマーだと思いますが、それとは明らかに異なっています。 普通のPCRも実施しました。鋳型なしとプライマー片方なしのコントロールを作りましたが、いずれもバンドはでませんでした。 毎回ハウスキーピングのNTCにのみコンタミしているとは考えにくいので、他の原因と思います。 ところで、先に質問しました、ピークが2か所の解釈は間違っていないでしょうか。 ターゲットサンプル群のピークとハウスキーピング群のピークで2つの温度にピークが出ています。

(無題) 削除/引用 No.11805-14 - 2023/09/27 (水) 22:02:29 - 774R >問題になっているNTCには鋳型有りと同じサイズにバンドがでました。 そのサイズはプライマーペア設計通りのアンプリコンサイズですか？ それがコンタミだとしたら、1/32も混じってくるような状況はありえますか？

(無題) 削除/引用 No.11805-13 - 2023/09/27 (水) 21:42:01 - T8 バンドが同じとなればコンタミだと思います。 ただ、操作によるコンタミであれば、ターゲットでもいつか出てくると思います。 毎回コントロールのみで出てくるとなると、他の原因な気がします。 ただし、ターゲットは発現量が低くてコンタミしても増幅されないという可能性は否定できませんが。 例えば、コントロールのNTCのみでPCRしたらどうなりますか？ つまり、操作中にコンタミしない条件でやるということです。 個人的にはこれでもバンドが出るのではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.11805-12 - 2023/09/27 (水) 19:36:10 - 0324 皆様 ご回答ありがとうございます。 電気泳動を行ったところ、問題になっているNTCには鋳型有りと同じサイズにバンドがでました。 ダイマーとは異なると思いますので、やはりコンタミでしょうか。 サンプルを変えても、試薬類を変えても出現しているところが気持ち悪いです。 ピークが2つというのは、全てのウェル（ハウスキーピングも、ターゲットも両方含めて）のピークが2つということです。 ハウスキーピング遺伝子サンプル群のピークとターゲット遺伝子のサンプル群のピークです。ハウスキーピング遺伝子のNTCのピークはハウスキーピング遺伝子サンプル群のピークと重なっております。 3年ほど前に同じターゲットで実験をしており、確認していたのですが、その際はNTCは増幅されておりませんでした。ただし、その時と使用している試薬が変わっています（同じメーカーのSYBR系で今回の方が上級品）。

(無題) 削除/引用 No.11805-11 - 2023/09/27 (水) 15:56:18 - T8 あのさんがおっしゃる通り、アガロース電気泳動で確認するのが良いです。 その際に、バンドのサイズは予測される増幅サイズになっているかと、 もしそうならば、NTCのサイズはそれと同等なのかで判断できます。 また、ピークが2つとおっしゃっていますが、 それはNTC単独ウェルから2つのピークが出ているのですか？ それとも、全てのウェル（ハウスキーピングも、ターゲットも両方含めて）のピークが2つということですか？ （恐らく後者だと思っています）

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