BioTechnicalフォーラム [ライゲーション]

全31件 ( 21 ～ 31 )　前 | 次　1/ 1. 2. /2

(無題)

No.1180-11 - 2012/11/22 (木) 23:46:55 - AA

横槍のようで恐縮ですが、
”BamHIとPstIの距離”というのはMCS内での話ではないでしょうか？
インサートを挟んで両側に来るというのは当然なのですが、
空ベクターを切断するときに近すぎると切れないことがある、
というお話を確認されているのだと思います。

(無題)

削除/引用

No.1180-10 - 2012/11/22 (木) 22:15:38 - Harmonia

そもそもの話となってもうしわけないが。

ぼくなら、KOD plusなど末端がそろうPCR酵素で増やし、
それをpGEM3zfのHincIIなどブラントエンドにライゲーションし、
取れたクローンの配列を全長確認し、
BamHIとPstIでそこから切り出して、発現ベクターに乗せ換え、
という手順にします。

流儀、かな？

(無題)

削除/引用

No.1180-9 - 2012/11/22 (木) 19:17:17 - PP

>DDで切っているのでセルフライゲーションは起きないだろうと高をくくっているのですが 37℃15min,50℃15min のCIAP処理をした方がよいでしょうか？

しっかり切れているのであればCIAPの必要もありませんし(実際私もやっていない)、もしCIAP処理をするにしても熱失活してそのまま使えばOKです。ゲル精製はCIAPしない時にしかしません。むしろその方が効率は高く思えます。ちなみに私は濃度計算もよっぽど上手くいかない時しかしません。アルカリ法で取ったベクター1μLを20μLの系で制限酵素消化、CIAP処理後熱失活。インサートはPCR産物を10μLくらい制限酵素処理後ゲル抽して10μLのTEへ。処理が済んだベクターを1μL、インサートを適当に。まぁ3μLくらいですかね。10μLの系でライゲーションさせて全量をトランスフォームしてます。これで失敗することはほとんどありません。

(無題)

削除/引用

No.1180-8 - 2012/11/22 (木) 18:59:30 - 犬

> プラスミドがテンプレートのPCRなので、ものがあればバンドやスメアにはなるとは思います。
> ただ、増えた条件と今回やろうとしている条件はテンプレートが異なりますよね。
>
> また、PCRは増えれば増幅された配列があることを示せますが、増えない場合に何が起きているのかは分かりません。
> 得られているプラスミドが、セルフライゲーションなのか、プライマーダイマー等のゴミ配列が入っているのか等の情報は、次の一手を考える際に役立ちます。
>
> CIAP処理を試すよりも優先順位は下がるでしょうけれども、制限酵素処理は問題解決に役立ちますし、
> 長期化するようであればシークエンシングも視野に入れた方がいいでしょう。

なるほど・・・たしかに何が起きているかは全く分からないのでその先につながりませんね・・・
現在CIAP処理込みでやり直しているのでそちらでは試してみようと思います．

> プライマーの設計時には余分な配列を考えられているので間違いはないと思いますが、制限酵素認識部位が近いとそれぞれで1 cutできても、2 cutできない場合はあります。

インサートがどれほどだと制限酵素部位が近いと認識されるのでしょうか？
今回のインサートは630ｂあるのですが・・・
こちら側の切断ははっきりと確認できないので心配ではあります．

> 足元をすくわれないように、一度MCSの配列を見ておいてはいかがでしょうか。
> ベクター側のBamHIとPstIは、ユニークなサイトですよね？

改めて確認も致しましたが
BamHI - 元々のインサート - PstI
となっていますしそれぞれ他で切れたり
元々のインサートを切断したりは致しません．

(無題)

削除/引用

No.1180-7 - 2012/11/22 (木) 17:20:00 - ~

>[Re:5] 犬さんは書きました :

> ベクター側でPCRがかからないことは確認済みです．
> そのためライゲーション後PCRがかかり、目的のサイズなら成功だろうと踏んでいます．
＆
> > PCRで産物が見えていないのは、条件が悪いのでは
>
> PCRに関しては嫌というほど行っているので条件は間違いないかと思います．
プラスミドがテンプレートのPCRなので、ものがあればバンドやスメアにはなるとは思います。
ただ、増えた条件と今回やろうとしている条件はテンプレートが異なりますよね。

また、PCRは増えれば増幅された配列があることを示せますが、増えない場合に何が起きているのかは分かりません。
得られているプラスミドが、セルフライゲーションなのか、プライマーダイマー等のゴミ配列が入っているのか等の情報は、次の一手を考える際に役立ちます。

CIAP処理を試すよりも優先順位は下がるでしょうけれども、制限酵素処理は問題解決に役立ちますし、
長期化するようであればシークエンシングも視野に入れた方がいいでしょう。

> > ベクターがBamHIとPstIの両方で同時に切ることができるかどうか
> 片方，両方で切断しアガゲルにより，ベクター側の切断は確認済みです．
> インサート側は差が小さすぎて正直なんともですがバンドを見る限り切れているように思えます．
プライマーの設計時には余分な配列を考えられているので間違いはないと思いますが、制限酵素認識部位が近いとそれぞれで1 cutできても、2 cutできない場合はあります。
足元をすくわれないように、一度MCSの配列を見ておいてはいかがでしょうか。

(無題)

削除/引用

No.1180-6 - 2012/11/22 (木) 17:15:37 - LIN28

ベクター側のBamHIとPstIは、ユニークなサイトですよね？

-- BamHI - 元々のインサート - PstI --- BamHI -- とかだと。。。

(無題)

削除/引用

No.1180-5 - 2012/11/22 (木) 16:37:05 - 犬

> まあ1:6ででも私はいいとおもいますが、もう少しインサート減らしてもいいという意見も出るような気がします。ただ1:3でできて。1:6は全く取れないということはまず起こらないでしょう。わたしはligationはO/N派です。

基本は1:10みたいな話を聞いていたので割合を高めにしていたのですが下げてみることにします．

> PCRを行ったということですが、これもせめて一度制限酵素で切ってインサートをみてください。といいますか、わざわざプラスミドを精製しておいて、PCRで確認しても、最終的に制限酵素で正しいかどうか確認することになると思うので、PCRは無駄なステップになってしまわないでしょうか。
> それともちゃんとしたコンストラクトを作るのが目的でなくて、配列を読んだりするのが目的とかでしょうか?

現在あるキットの問題だと思うのですが取得できるプラスミド量が少なすぎて制限酵素で切りゲル確認よりもインサート作成時に用いたプライマーでPCRした方がバンドとして見えるのでこの方法でやっています．
ベクター側でPCRがかからないことは確認済みです．
そのためライゲーション後PCRがかかり、目的のサイズなら成功だろうと踏んでいます．

> 何個ですか?物によりますけど、1000個以上は生えてもよさそうです。ただし少なくてもうまくいっている場合がありますけど。50個ぐらいで、全く入っていないのなら、ライゲーション自身か、何らかの理由でライゲーションがうまく行かない、或いはコンピテントの効率がわるいなど疑いますが。。。

100個程度ですがライゲでなく単純な形質転換時でも似たはえ方なので問題視はしていませんでした．これに関してもやはりネガコンとらないと何とも言えないですよね・・・

> アガロースから精製する時に精製用のキットで十分除タンパクができます。

ありがとうございます．平気と言われたり除去必要と言われたりまばらなので不安でした．

> ネガコンとしてインサートを入れずに、ベクターのみをライゲーション処理したサンプルを作っていないのでしょうか？
> せめてベクターだけでライゲーションしたネガティブコントロールがあればある程度の察しがつきます。その他疑うものにたいしてそれぞれのネガティブコントロールをおくこともできます。

今回ネガコンに関しては全く行っていなかったので次回行ってみます．

> ベクターがBamHIとPstIの両方で同時に切ることができるかどうか

片方，両方で切断しアガゲルにより，ベクター側の切断は確認済みです．
インサート側は差が小さすぎて正直なんともですがバンドを見る限り切れているように思えます．

> プライマーに付加した配列が妥当か

F Primer（BamHI サイト付加）
AAT-GGATCC-ATGGGCTCCGTGTCCAAC
R Primer（PstI サイト付加）
ACG-CTGCAG-TCATCAATTCTGTGCCTC

の形で作成しています．

> PCRで産物が見えていないのは、条件が悪いのでは

PCRに関しては嫌というほど行っているので条件は間違いないかと思います．

(無題)

削除/引用

No.1180-4 - 2012/11/22 (木) 15:22:54 - おお

>[Re:1] 犬さんは書きました :

> 《ライゲーション》1:6でタカラのligation highで16℃、1hしています。

まあ1:6ででも私はいいとおもいますが、もう少しインサート減らしてもいいという意見も出るような気がします。ただ1:3でできて。1:6は全く取れないということはまず起こらないでしょう。わたしはligationはO/N派です。

(無題)

削除/引用

No.1180-3 - 2012/11/22 (木) 15:18:31 - おお

ー ~さんが殆ど考えられることを指摘されています。
せめてベクターだけでライゲーションしたネガティブコントロールがあればある程度の察しがつきます。その他疑うものにたいしてそれぞれのネガティブコントロールをおくこともできます。

PCRを行ったということですが、これもせめて一度制限酵素で切ってインサートをみてください。といいますか、わざわざプラスミドを精製しておいて、PCRで確認しても、最終的に制限酵素で正しいかどうか確認することになると思うので、PCRは無駄なステップになってしまわないでしょうか。

それともちゃんとしたコンストラクトを作るのが目的でなくて、配列を読んだりするのが目的とかでしょうか?

>この結果ある程度のコロニーがはえ

何個ですか?物によりますけど、1000個以上は生えてもよさそうです。ただし少なくてもうまくいっている場合がありますけど。50個ぐらいで、全く入っていないのなら、ライゲーション自身か、何らかの理由でライゲーションがうまく行かない、或いはコンピテントの効率がわるいなど疑いますが。。。

> また、CIAP後は酵素失活せずそのままアガロース精製で平気とお聞きしましたが問題ないのでしょうか？

アガロースから精製する時に精製用のキットで十分除タンパクができます。

(無題)

削除/引用

No.1180-2 - 2012/11/22 (木) 14:36:32 - ~

ネガコンとしてインサートを入れずに、ベクターのみをライゲーション処理したサンプルを作っていないのでしょうか？

それを用意していれば、ご自分で
>37℃15min,50℃15min のCIAP処理をした方がよいでしょうか？
や、ベクターの調整からのやり直しが必要かについて判断ができると思います。

情報が書かれていませんので、
・ベクターがBamHIとPstIの両方で同時に切ることができるかどうか
　2cutされていることが確認できるデータがあればいいのですが、近すぎて切れないこともあるでしょう。

・プライマーに付加した配列が妥当か
　末端に2^3merの塩基を付加していますよね？
　当たり前なので書いていないのか、知らないので書いていない（やっていない）のかで話が変わってきます。

・PCRで産物が見えていないのは、条件が悪いのでは
　PCRで期待される位置にバンドがないのでしょうけれども、セルフライゲーションが取れているとはわかりません。
　何が得られているのかが分かれば、原因追及に役に立ちます。

等が分かりません。

ライゲーション

削除/引用

No.1180-1 - 2012/11/22 (木) 14:14:15 - 犬

いつも拝見させて頂いております。
今回初めて、ある遺伝子のORFをインサートとしたベクターを作製し、
培養細胞にtransfectionすることになりました。
そこで以下の条件でやっているのですがなかなかうまくいかないため、皆様のご意見を伺えればと思います。

《ベクターの調整》
①ベクター5ngをBamHIとPstIで37℃、2h処理したその後,1%のアガロースゲルで100V, SYBR GOLDを用いて後染めして4.8kbのサイズを切り出します。切れ残りは見えず，もともと入っていたインサートは下流に見えますのできちんと消化はされていると思います。

《インサートの調整》インサートはBamHIとPstIのサイトを付加したプライマーを用いてPCR産物の両端をBamHIとPstI処理し、アガロースで流して630bのサイズを切り出しています。

切り出しは流したレーンの端を切り落とし，場所を確認後切り出しています．
その後の確認もしています。抽出にはQIAquick Gel Extraction Kitを用いています。

《ライゲーション》1:6でタカラのligation highで16℃、1hしています。ベクターの量を10ngにし、その後JM109のコンピテントセル100μLに形質転換しています。

この結果ある程度のコロニーがはえ，プラスミドを抽出後プライマーを用いたPCRによるインサートの確認をすると産物が確認されません．
DDで切っているのでセルフライゲーションは起きないだろうと高をくくっているのですが 37℃15min,50℃15min のCIAP処理をした方がよいでしょうか？

また、CIAP後は酵素失活せずそのままアガロース精製で平気とお聞きしましたが問題ないのでしょうか？
上記のやり方でどこか直したほうがよいところがあれば、アドバイスを頂ければ幸いです。どうぞよろしくお願いいたします。

全31件 ( 21 ～ 31 )　前 | 次　1/ 1. 2. /2

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

〔使い方〕

「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。