いつも拝見させて頂いております。
今回初めて、ある遺伝子のORFをインサートとしたベクターを作製し、
培養細胞にtransfectionすることになりました。
そこで以下の条件でやっているのですがなかなかうまくいかないため、皆様のご意見を伺えればと思います。
《ベクターの調整》
@ベクター5ngをBamHIとPstIで37℃、2h処理したその後,1%のアガロースゲルで100V, SYBR GOLDを用いて後染めして4.8kbのサイズを切り出します。切れ残りは見えず，もともと入っていたインサートは下流に見えますのできちんと消化はされていると思います。
《インサートの調整》インサートはBamHIとPstIのサイトを付加したプライマーを用いてPCR産物の両端をBamHIとPstI処理し、アガロースで流して630bのサイズを切り出しています。
切り出しは流したレーンの端を切り落とし，場所を確認後切り出しています．
その後の確認もしています。抽出にはQIAquick Gel Extraction Kitを用いています。
《ライゲーション》1:6でタカラのligation highで16℃、1hしています。ベクターの量を10ngにし、その後JM109のコンピテントセル100μLに形質転換しています。
この結果ある程度のコロニーがはえ，プラスミドを抽出後プライマーを用いたPCRによるインサートの確認をすると産物が確認されません．
DDで切っているのでセルフライゲーションは起きないだろうと高をくくっているのですが 37℃15min,50℃15min のCIAP処理をした方がよいでしょうか？
また、CIAP後は酵素失活せずそのままアガロース精製で平気とお聞きしましたが問題ないのでしょうか？
上記のやり方でどこか直したほうがよいところがあれば、アドバイスを頂ければ幸いです。どうぞよろしくお願いいたします。
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