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(無題) 削除/引用 No.11776-10 - 2023/09/12 (火) 19:53:07 - タコ 目的は、タンパク質精製用のタンパク質の高発現です。 OD 0.5付近でIPTGを添加して、4〜6時間ほど培養後、対数増殖期中に回収しようとしてます。 10mlをオーバーナイトでカルチャーして、37度に温めていた１Lの培地に、朝に前培養したものを全部入れるとODが0.03~0.05ぐらいになるのですが、1−2時間はほとんど増えないことがあります。その後、0.5~1時間の倍化時間で増えていきます。 タンパク質によって、１L培養の立ち上がりに3，4時間かかってしまい、その後IPTG添加してからの培養時間を考えると、夜に回収するのが難しい場合もあるため（とはいえ、１Lでオーバーナイトするとコンフルになってしまう）、もっとスムーズに１L培養を立ち上がればなぁと思っている次第です。

(無題) 削除/引用 No.11776-9 - 2023/09/12 (火) 19:07:17 - G25 >オーバーナイトの時の温度を調整すればいいと思うけど。 増殖速度を下げるために温度を下げると（30℃以下とか） pUC系のプラスミドだとコピー数が下がったりしますね。 その他にも、温度を変えることに依る遺伝子発現の変化、生理的な変化が、 実験結果や再現性に影響する可能性がなきにしもあらず。 ベクターからの漏れ発現による毒性で増殖が阻害されるときなんかには、抑制のためにあえて温度を下げたりもしますけど。

(無題) 削除/引用 No.11776-8 - 2023/09/12 (火) 18:19:31 - G25 大量培養する目的に依ると思いますが、 多くの場合、対数増殖期を目指して培養することが多いと思います。 前培養液(starter culture)を大量の培地に接種すれば、濁度を見つつ朝はじめて、帰宅時間の前に目的の濁度（例えばOD600=0.5)が得られるでしょう。 シングルコロニーを接種して大量培養をしようとすると、時間読みが難しい。ひょっとすると真夜中に目指す濁度に達してしまうかもしれない。 余談ですが、 高効率コンピーテントセルを調製するノジマ法の原法では、 1 Lレベルの大きな培地に、直接、ピックアップしたコロニーを、数個、接種するというふうになっていた記憶があります。複数コロニーを接種することで接種する菌数を上乗せするってことだと思いますけど。 ノジマ法では、培養温度を18℃など低温にしますので、対数増殖期の時間が長くなりますので、うっかり培養しすぎってことも起こりにくいので、昼のうちに対数増殖期にするためにstarter cultureを大スケールの培地に接種するというのがあまり意味ないのかも。 もっともMolecular Cloningに載っているノジマ法はstarter cultureを接種して本培養にかかる（接種量を振って、ちょうどよく増殖したものを選んで使用する）となっていたと思います。 >しかし、オーバーナイトカルチャーの間に、ODが3近くになり、対数増殖期が完全に過ぎ、１Lに移した後も数時間は増殖が悪いです。2−3時間すると増え始めます。 植菌直後の濁度の値が小さいところから、徐々に倍化しているのですから、 初期には濁度の測定値は低くちょっとして誤差に依る変動率が高いし、増分が小さいので、一見、増殖が悪く見えるのかもしれません。 リアルタイムPCRの初期サイクルいわゆる「ベースライン」の段階では増殖曲線が見えてこないのと同様で。 あと、植菌した時点で培地は培養温度に平衡化しているのでしょうか。 まさか、冷蔵庫からだしたばっかりで冷えた状態から培養を開始しているなんてことは、

(無題) 削除/引用 No.11776-7 - 2023/09/12 (火) 17:59:39 - asan >コロニーをいきなり大量の液体培養に移すことは、よくない理由があったりしますでしょうか？ それでも増やすだけなら増えるけど、変なコロニーをピックしてた場合はうまく増えない可能性がある。 また、コロニーピックは定量的ではないのでコロニーの突き方によって初期値がばらつくので安定しませんね。 それをやるぐらいなら、少量で増やしてからスケールアップするときの容量を調整して増やし直す方がマシ。

(無題) 削除/引用 No.11776-6 - 2023/09/12 (火) 16:45:08 - momo １Lカルチャーの目的は何ですか？タンパク質発現？ ODが3程度ならそれほどカチカチ（？）に生えてるというわけでもないので、対数増殖に戻るのに何時間もかかるのは普通じゃないように思います。 単に本培養初期の菌数が少なくてODがきちんと測定できていないということはありませんか？

(無題) 削除/引用 No.11776-5 - 2023/09/12 (火) 16:23:09 - タコ みなさま、ありがとうございます。 確かに、増殖速度が、コロニーの大きさによるので、朝にどのくらい増えているか、毎回一定しないですね。 数ｍｌのカルチャーでも、温度制御なら、朝に対数増殖期を調節しやすそうですね。 条件検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.11776-4 - 2023/09/12 (火) 14:57:54 - おお オーバーナイトの時の温度を調整すればいいと思うけど。

(無題) 削除/引用 No.11776-3 - 2023/09/12 (火) 14:07:12 - ああ 私は２００ml培養で時短テクとしてやったことありますがコロニーを移すこと自体は経験上問題なかったです。 ただ液体培地の菌数にくらべかなり少ない菌数で始めるわけですからそれなりに時間はかかりますし、オーバーナイトだとOD600＝1.0超えると思うのであまりお勧めはしないですね。 ちなみにですか、precultureは菌数稼ぐためなので同条件で１Lに入れる量を10mL(1/100量)でやるともっと早く増え始めると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.11776-2 - 2023/09/12 (火) 14:03:48 - WInter-8 そのようにしている研究室もありますが、増えないこと（増殖が著しく遅くなること）があります。 また、増えたとしても定常期に至るまでの時間が一定しません。複数のフラスコ（ボトル）で培養する場合はフラスコ毎にバラつきますし、再現をとれない恐れがあります。

大腸菌の大量培養前の培養 削除/引用 No.11776-1 - 2023/09/12 (火) 13:09:38 - タコ 大腸菌を１Lカルチャーする場合に、プレートからコロニーを、数mlの液体培地に移して、オーバーナイトカルチャーした後、翌朝に、１Lに移して、カルチャーしております。 しかし、オーバーナイトカルチャーの間に、ODが3近くになり、対数増殖期が完全に過ぎ、１Lに移した後も数時間は増殖が悪いです。2−3時間すると増え始めます。 そこで、思ったのですが、プレートからコロニーを、直接１Lに加えて、オーバーナイトカルチャすればいいと思ったのですが（ODがオーバーナイトしていっぱいにならない限り）、コロニーをいきなり大量の液体培養に移すことは、よくない理由があったりしますでしょうか？ ご教授いただけると助かります。

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