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(無題) 削除/引用 No.11768-4 - 2023/09/11 (月) 09:46:41 - おお PFAなどで固定するとＧＦＰとかの蛍光は弱くなりますね。ですから発現量や分布の仕方次第では見えなくなるというのも本当のところだと思います。 固定で蛍光が弱くなるので、コントラストがついたり部分的にシグナルがない様なイメージになることはあります。 固定法、抗体によるイメージの違いは方法論が出来上がった時からの課題だと思ってます。 減弱しているように見えないのは、露光時間その他撮影条件でカバーしていると思われますが、そのあたりの記載はないですか？

(無題) 削除/引用 No.11768-3 - 2023/09/10 (日) 21:27:55 - G25 ライブイメージングは無固定、無透過処理、試料厚み(培地コミだったり)なんかの条件でやるから、固定試料よりボケて不鮮明なのは当然だと思う。 蛍光タンパク質は溶媒系の固定には弱いけど、アルデヒド固定には実用レベルで耐えて、常用されている。

(無題) 削除/引用 No.11768-2 - 2023/09/10 (日) 21:09:53 - toto どなたもお答えないのはこの話がここで何度も出てきているからですが、一応書いておきます。PFA固定であれば固定液中ではGFP系の蛍光はきえますが、固定液を除けば復活してきます。RFP系でもだいたい同じです。ただ有機溶媒系はGFP系は、その種類によって復活したり、しなかったりします。RFP系はほぼダメ。 いずれも抗体染色の見え方と自家蛍光の見え方が結構異なることはあります。異なる理由はいろいろですが、固定さえ文字通りに分子がその構造に固定されていて、その構造が保存されているならば、免染で見える蛍光タンパクの局在が正しいはずです。自家蛍光のほうが環境の影響を受けやすいので。 ただ、文字通りに分子が構造に固定されることも、細胞内構造のすべてが生きた状態のまま固定されることも普通の免染プロトコールではできません。PFAでは3-4日間くらい固定しないと細胞内一分子の固定ができませんし、それでも小胞体の形は壊れます。有機溶媒系では固定というより変性させてその辺にくっつけるだけなので、細胞質タンパクは漏れ出て、むしろそれを利用して細胞質の染色を下げる事も良くされます。微妙ですが。 その論文、数ヶ月前にでたものですよね。私も読んだと思うのですが、何を今更、というのが正直な感想でしたが、発表するのは大事だなとも思いました。

GFPtag proteinの固定後の蛍光の件 削除/引用 No.11768-1 - 2023/09/08 (金) 22:05:33 - BBB 固定処理中に細胞内タンパク質の局在がダイナミックに変わることがあり間違った結論を導くことがあるので気をつけましょうという論文をさっき読みました。でGFP-tag タンパク質を発現させてlive imagingで観察した時と、その細胞をホルムアルデヒド（１hrくらいしてる）とか有機溶媒とかいろいろ方法をかえて固定してから観察した時とで、局在部位がかなり違うというデータで説明されてました。それはそれで重要な発見とおもうのですが、GFPやRFPなどの蛍光タンパク質の蛍光は固定後も見えるのでしょうか。むかし固定したら見えなくなるとか聞いたのですが、Figをみるかぎりでは減弱してるようには見えず、私の目には固定後の方がlive imagingと同等かむしろより鮮明にみえます。で、このタンパク質に対する抗体で蛍光抗体法でも染色してるのですが、これも固定法によりまた違った分布パタンを示しています。

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