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(無題) 削除/引用 No.11754-9 - 2023/09/12 (火) 04:34:34 - s 皆さま 色々なアドバイスありがとうございました。 ハウスキーピングの種類によってCt値が大きいものや小さいものがあり、 複数のハウスキーピングで検討することの大切さがわかりました。

(無題) 削除/引用 No.11754-8 - 2023/09/03 (日) 09:11:51 - おお あ、それと薬剤負荷で細胞がもう死んでいるも同然の状態であったりしない？

(無題) 削除/引用 No.11754-7 - 2023/09/03 (日) 09:10:05 - おお 電気泳動でチェックすぐのように思うけどね。 プラスミドをチェックするようなアガロースゲルでも変性して泳動１０分以内ぐらいに検出すればだいたいわかる。

(無題) 削除/引用 No.11754-6 - 2023/09/02 (土) 23:17:57 - s G25様 ご回答ありがとうございます。 とても参考になりました。 複数のハウスキーピングなども測定してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.11754-5 - 2023/09/02 (土) 14:36:30 - G25 処理によっては発現量が変動するハウスキーピング遺伝子もあります。 複数のハウスキーピング遺伝子をみても、同様にCtが高くなっているのかいないのか、見ておいたほうがいいと思います。その中にclass II遺伝子、つまりタンパク質に翻訳されるmRNAだけじゃなくrRNAも含めておくのが私は好み。 どのハウスキーピング遺伝子も一斉にCtが高くなっているなら、定量が不正確だったり、分解によって目減りしている可能性を考える必要があるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.11754-4 - 2023/09/02 (土) 14:26:12 - G25 OD260/280 ratioはタンパク質など核酸以外の物質の夾雑の指標です。核酸の分解の度合いは判定できません。 純粋なDNAまたはRNAで測定するとRatioはぞれぞれ1.8または2.0になるという事実から、吸光スペクトラムのことなる不純物が混じっているとratio値がずれるというだけ。逆に言うと、ratioがおかしな値なら不純物があるというのは確実ですが、それらしい値だったら不純物がないととは断言できません。不純物によってはたまたま良い値をもたらすかもしれませんので（例えば260 nmに吸光ピークがあるものなど）。 RNAサンプルのintegrity/intactnessを見るのにはHCHOなどで変性条件にした電気泳動でrRNAの分解度合いを見る必要があります。 最近ではAgilent社のBioanalyzerで泳動して、28S rRNAと18S rRNAの強度比から算出したRNA Integrity Number (RIN)を指標にするのがトレンドですね。

(無題) 削除/引用 No.11754-3 - 2023/09/02 (土) 12:30:44 - s おお様 ご回答ありがとうございます。 これら２つのサンプルのNanodropの定量では いずれも純度は高いのですが、それ以前の話でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11754-2 - 2023/09/02 (土) 10:57:42 - おお 問題あると思います。 ＲＮＡ精製の時にＲＮＡが分解してないか気になります。

qPCRについて 削除/引用 No.11754-1 - 2023/09/02 (土) 09:43:33 - s q-PCRについて質問です。 コントロールと薬剤負荷の２群の比較で、ある遺伝子の発現差をq-PCRで比べています。 同じ細胞数で、同じようにサンプルを作成したのですが、 ハウスキーピングの量がずいぶん異なります。（コントロールCT値が２０で薬剤が２７くらい） このような状態で遺伝子発現差を比べるのは問題ないでしょうか？ （コントロールを薄めて評価した方がよいかと考えております。）

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