>[Re:3] APCさんは書きました :
> > 2.KO処理した細胞としていない細胞を動物に導入して比較する予定ですが。コントロールもレンチにかける必要はあるのでしょうか。
>
> するのがベストと思います。
>
> これはウイルスで処理するとoff target効果で本来のコントロールとは違う編集がおきたりする可能性もあると思うので、果たしてコントロールも処理するのがいいのか、悩みます。
ウイルスの導入で起こる細胞の変化が無視できる保証はないです。
>
> そういう意味ではレンチよりもアデノで一過性発現がいいのですかね。。
そういう手はあると思います。まぁどちらもよく使われる手法ではありますから、自身の実験でどちらがいいかは具体的に何を見るのかわかりませんので判断はお任せします。アデノなら繰り返し感染で効率を上げていくこともできるのかな？
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> > 1. レンチウイルスを使用して、Cas9とsgRNAを一つのプラスミドで導入する予定で、レンチで遺伝子導入した後、セレクションをかけて、signle cloneを取る必要があるのでしょうか。
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> ウイルスベクターの感染効率=KOの効率ではないのでは？
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> それは考えているのですが、Cas9の効率はかなり高いので、sigle clone化して、長期培養することによる性質の変化も少し気になってしまいます。
継代することの細胞の変化が許容範囲を超えると考えるのなら、確かにsingle cloneをとると実験が成り立たなくなります。株化されたがん細胞ではふつうはシングルクローンをとると思います（分化したり変化があるものは別かもしれません）。
ホントに効率よくってかなりポピュレーションがＫＯされているなら、継代（分裂回数）による変化がクリティカルな系で、single cloneをとらずに解析することはそれは一つの方法論としてありだと思います。しかしながらすでにいろいろな方が指摘するデメリットは存在します。効率が悪い場合は妥協できるというなら、感染、選択後半分ぐらいを凍結するか、シングルを拾う操作を初めて、残り半分はＫＯ効率などみて判断するというのも手かもしれません。
もう少し確実にというなら、たとえばＣＭＶ ＧＦＰーＰｏｌｙＡ Ｓｉｔｅ などをそこにターゲッティングしてＧＦＰ Ｐｏｓｉの細胞をＦＡＣＳ ｓｏｒｔｉｎｇで集めるとか。効率がどの程度になるかわかりませんし、それでも両アレル入っているかどうかわからないわけですが、高発現側半分を拾うとちょっと確率は上がるかもしれません。まあＧＦＰが入らなくともつぶれている場合はあるでしょうけど。 |
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