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FACSで固定/透過処理後の細胞サンプルのソーティング後のRNA抽出 トピック削除
No.11741-TOPIC - 2023/08/25 (金) 12:57:04 - フロ子
お世話になります。最近、ようやくFACSのソーティングを開始し始めたものになります。基本的な質問過ぎて不快になられるかたがいたら申し訳ありません。

現在Ｔ細胞をサイトカイン刺激して培養、それをＦＡＣＳにて回収してきております。表面のみの染色では目的ポピュレーションは1万個ほどの回収で、RNA抽出（nanodropで2ng/ul程度）しRT-PCRがなんとかできています。ただサイトカインの遺伝子が思ったほど高くありませんでした。

そこで今回、固定/透過処理して細胞内染色で目的のサイトカイン産生細胞をとってきました。同細胞数でRNA抽出はnanodrop 3.8ng.ul程度でした。上記より時間がかかるのでon iceにしたり、表面のみのときは5mlラウンドチューブで回収していたのを1.5mltubeに直接回収したり（回収の培地は培養液ですが）、RNA抽出はカラムkitを使用していたのを、tryzol＋カラム法に切り替えるなどしました。上記のようにnanodropでもある程度高いし、今度こそは、と思ってPCRを回してみたところ全くハウスキーピング含めcDNAの増幅がありませんでした。試薬等は問題ないこと、確認しております。
あとはtryzol＋カラム法の手技か、固定/透過処理の影響かというところです。

固定/透過処理した細胞も、RNA抽出し、PCR行うこと可能でしょうか。ご存じ、またはご経験のあられる方いらっしゃればお返事いただければ幸いです。
　
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(無題) 削除/引用
No.11741-5 - 2023/08/26 (土) 15:33:38 - あの
初代細胞ですが、似たようなことをしようとして断念したことがあります。

RNAが細胞内で壊れるか、思ったほどRNAが多くないかのどちらかが原因だと思います。

念のため、次の確認をしてみたらどうでしょう。

（１）細胞をFACSにかけずに、同程度の待ち時間の後で、どの程度RNAがとれるか確認する。

（２）固定のためにはPFAなどではなく、Cell coverを使う。
　　　　https://www.funakoshi.co.jp/contents/7571

（３）ソートされた細胞がすぐにRNAlaterなどに入るようにする。

なおRNA抽出以前の問題で、抽出キットによる差は無いだろうと想像しています。

(無題) 削除/引用
No.11741-4 - 2023/08/26 (土) 13:42:11 - おお
活性が思ったより高くないというのは感覚の話ですか？それとも何か客観的な指標があるのですか？

また、細胞の生理的状態など、そう言う所でうまくいってない可能性は無いですか？そのような理由で処理しなくても既に上がってしまってるとか、ちゃんと反応しないとか。

そのサイトカインを発現している細胞を回収して、そのサイトカインの発現を見ることに実験的意義を見出せますか。むしろ、発現している細胞のポピュレ-ションが上がっている事を示した方が良くないですか？蛍光強度の比較もできるでしょうし。

(無題) 削除/引用
No.11741-3 - 2023/08/26 (土) 11:36:08 - おお
そういうのは詳しくないけど、固定とかすると細胞膜のIntegrityが損なわれるから外からRNaseとか侵入するだろうし、ＲＮＡは回収できても分解が進んでるのではないかな。

(無題) 削除/引用
No.11741-2 - 2023/08/25 (金) 14:36:12 - あ
RNAを抽出せずに、細胞のまま直接RT-PCRすればいいです。
染色後すぐにRT-PCRまで持っていけるなら、固定も不要です。

FACSで固定/透過処理後の細胞サンプルのソーティング後のRNA抽出 削除/引用
No.11741-1 - 2023/08/25 (金) 12:57:04 - フロ子
お世話になります。最近、ようやくFACSのソーティングを開始し始めたものになります。基本的な質問過ぎて不快になられるかたがいたら申し訳ありません。

現在Ｔ細胞をサイトカイン刺激して培養、それをＦＡＣＳにて回収してきております。表面のみの染色では目的ポピュレーションは1万個ほどの回収で、RNA抽出（nanodropで2ng/ul程度）しRT-PCRがなんとかできています。ただサイトカインの遺伝子が思ったほど高くありませんでした。

そこで今回、固定/透過処理して細胞内染色で目的のサイトカイン産生細胞をとってきました。同細胞数でRNA抽出はnanodrop 3.8ng.ul程度でした。上記より時間がかかるのでon iceにしたり、表面のみのときは5mlラウンドチューブで回収していたのを1.5mltubeに直接回収したり（回収の培地は培養液ですが）、RNA抽出はカラムkitを使用していたのを、tryzol＋カラム法に切り替えるなどしました。上記のようにnanodropでもある程度高いし、今度こそは、と思ってPCRを回してみたところ全くハウスキーピング含めcDNAの増幅がありませんでした。試薬等は問題ないこと、確認しております。
あとはtryzol＋カラム法の手技か、固定/透過処理の影響かというところです。

固定/透過処理した細胞も、RNA抽出し、PCR行うこと可能でしょうか。ご存じ、またはご経験のあられる方いらっしゃればお返事いただければ幸いです。
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