全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.11738-6 - 2023/08/25 (金) 09:00:43 - あああ 全体的に低いんだと還元剤や先のJJJ様の言っているRunnning Bufferの問題も考えられる気がします。 DTTとか水溶液にすると失活しやすく還元されないとsupercoil同様に分子量が小さくなりますし、Runnning Bufferが混ざってないだけでも泳動像は乱れます。

(無題) 削除/引用 No.11738-5 - 2023/08/24 (木) 22:17:20 - おお ゲルが古くなっている可能性は無いですか？ 自作でpH8.8のゲルバッファーで二週間経った頃から高分子の方から分解能が低下してきます。

(無題) 削除/引用 No.11738-4 - 2023/08/24 (木) 21:32:43 - JJJ お話を伺う限りでは、ブロッティングでなくて、電気泳動の段階で問題が起きてるように思われます。 前はうまくいっていたということなので、最近、試薬をあたらしく買い直したり、自作試薬であらたに作ったりしたものはありますか。で、濃縮ゲルと分離ゲルのbufferを間違えて逆にして使ってるとか（お話の感じからなんとなくこれのような気がすこししてます）、市販のアクリルアミド-ビス混合液原液(40％とか30%とか37.5:1とか29:1とか濃度と混合比のことなるものがいろいろありますので）の濃度が以前と違うのを以前と同じ容量でつかっているとか。

(無題) 削除/引用 No.11738-3 - 2023/08/24 (木) 20:00:41 - バンバンジー 抽象的なご相談に対し、ご回答ありがとうございます。 >[Re:2] 774さん > 転写がうまくいっていないわけではなくて? ウエスタンブロッティング自体は何度も何度もやってきた実験なので、転写ミスなどの手技的なミスはあまり考えにくいのかなと思っています。 > CBBとかでゲルとメンブレン両方染めてみてはどうですか。 今後やってみようかなと思っています。 > 「圧縮されて泳動」ってどういうことを想定しているんですか? > グラジエントゲル? > 濃縮ゲルがうまく作れてない? > そもそもどういうセッティングで実験しているんですか? どういう表現が正しいのか分からず、とりあえず「圧縮されて泳動」と表現したのですが、マーカーなどに付属している泳動の例の間隔よりも、狭くなっており、ゲルの半分より下の部分に圧縮されているように見受けられるのでそのように表現しました。(図示できないため説明が上手くできず申し訳ないです) ゲルはSDSポリアクリルアミドゲルです。 ウエスタンブロッティング自体はタンク式で行っています。 泳動の条件は次の通りです。 ・Stacking gel1枚：10mA (2枚の時は20mA) / 300V / 30min ・Running gel1枚：20mA (2枚の時は40mA) / 300V / 60min 転写の条件は次の通りです。 ・300mA / 25V / 90min > 90kDa付近に見えるはずのものが50kDa付近に見えるというのはただのノンスぺではないの? > 以前はうまくいっていたのがうまくいかなくなったのか、初めてやって想定と違う結果なのか、どちら? 今回の実験は以前はうまくいっていたのに、ここ最近急に不調になっていて困っています。 確かにノンスペも考えられますが、GAPDHも本来の分子量より低いところかにか出ており、違和感を感じています。

(無題) 削除/引用 No.11738-2 - 2023/08/24 (木) 18:25:59 - 774 転写がうまくいっていないわけではなくて? CBBとかでゲルとメンブレン両方染めてみてはどうですか。 「圧縮されて泳動」ってどういうことを想定しているんですか? グラジエントゲル? 濃縮ゲルがうまく作れてない? そもそもどういうセッティングで実験しているんですか? 90kDa付近に見えるはずのものが50kDa付近に見えるというのはただのノンスぺではないの? 以前はうまくいっていたのがうまくいかなくなったのか、初めてやって想定と違う結果なのか、どちら?

ウエスタンブロッティングで高分子量が正常に分離できない 削除/引用 No.11738-1 - 2023/08/24 (木) 17:59:48 - バンバンジー ウエスタンブロッティングで泳動をしたときに、高分子量の部分(50kDa以上)が消えてしまう現象が続いています。 そのまま転写、検出をすると、マーカーが見える分子量の部分のタンパクは見えるのですが、消えている高分子量部分ではタンパクが検出できません。（大体90kDaあたりで見えるはずのタンパク質のバンドが、マーカーのバンドが50kDaと思われる場所に見られました。高分子量部分が見えないというより、ずれた位置に出ている？） 高分子量の部分で正常の分離ができていないことや、圧縮されてタンパクが泳動していることを考えたのですが、何か考えられる原因や解決策などご存じでしたら教えていただきたいです。

全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---