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(無題) 削除/引用 No.11638-9 - 2023/07/27 (木) 07:41:19 - 西 みなさま ありがとうございます！ ブロッキング試薬のまま保存するか洗浄して保存するかは状況によりけりだが週跨ぎは何らかの方法で可能、というご意見が多く大変参考になりました。ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.11638-8 - 2023/07/22 (土) 09:32:47 - B 再開時のスケジュールがまだわからないときは、転写して水で数回メンブレンを軽く洗ってから水に沈めて、４℃保存が無難かとおもいます。経験ではすくなくとも１週間程度は問題なくできてます。変な感じに乾燥させないこととカビに注意することです。（１週間ではカビは出てこないのであまり関係ないですが。） 2週間くらいたつとシグナル強度が弱くなる感じがしますので、あまり長期保存は勧めません。 翌日に続きをするならば、転写、ブロッキング（１hr程度）、抗体反応（４度）までやって翌日、洗浄から始めるというのは昔からみなさんされていると思います。抗体にもよりますが大抵の場合は室温１hrsでも4℃一晩でもシグナル強度やバックグラウンドに明らかな差異はみられません。 ブロッキングの状態で止めるのは勧めません。シグナル強度が減弱することがあるため、もともと弱いシグナルだと検出できなくなることがあるかもしれません・。

(無題) 削除/引用 No.11638-7 - 2023/07/21 (金) 15:41:54 - G25 ブロッキング液 あるいは 通常のWashで使っているTBSやPBS（プラスtween 20/TX-100） で冷蔵保存でいいと思います。 オーバーブロッキングは経験したことないですが、心配でしたら後者で。 一次抗体液は処理時間に比例してバックグラウンドが上がってくるので、作業を中断させるためだけのために不必要に時間を延長するのはやめたほうがいい。

(無題) 削除/引用 No.11638-6 - 2023/07/21 (金) 13:29:43 - YK BSAブロッキング後、PBS（PBSTだとBSAが落ちそうなので）に浸して4℃保存、後日抗体反応はよくやります。 学会挟んでDay１ブロッキング、Day５検出とやったときは大差ない結果は得られました。 スキムミルクのような腐敗しやすいブロッキング材の時はブロッキングせずPBS中に保管して、次回ブロッキングから再開してました。 ブロッキングの状態では４℃ O/N以外はオーバーブロッキングになりそうなのでやったことないです。

(無題) 削除/引用 No.11638-5 - 2023/07/21 (金) 13:25:18 - tts 週末をまたぐ場合は、トランスファーまで実施してTBS ４℃で中断。週明けてからブロッキング以降を実施してますが、今まで特に問題になったことはありません。

(無題) 削除/引用 No.11638-4 - 2023/07/21 (金) 12:25:22 - あの Day1にブロッキングして、洗浄なしで、1次抗体反応を冷蔵庫でオーバーナイト を基本にして、 1次抗体反応時間は（抗体にもよるでしょうけど）、月曜朝まで延長できると思う。 ブロッキング剤や濃度も検討すれば、ブロッキング時間も短くできると思う。

(無題) 削除/引用 No.11638-3 - 2023/07/21 (金) 11:43:09 - み 土曜から一次抗体は良くやる 明日もやるわ。もともとブロッキングにアザイド入れてあるから腐らないと思う。 抗体に依ってはバックが高くなるものもあるかもしれん。 ブロッキングで数日置くのはあまり良くない印象。シグナルが弱めにでるかな

(無題) 削除/引用 No.11638-2 - 2023/07/21 (金) 11:38:55 - おお 大抵は大丈夫です。ブロッキング剤が何かによっては、長期間置いておくとバクテリアが生えて着たり、オーバーブロッキングになってしまうので、転写して乾かして−２０度で保存とかよくやります。乾かさないでPBSTにつけてー２０度とかPBSTにつけて４度保存とかそれなりのバリエーションもあり得る選択です。とくにPVDFなら乾かさないほうがそのあとの操作がしやすいです。 ブロッキングのあと洗浄しているのですか？ブロッキングでついたものを落としているとしたらなんだかなぁって感じがしますが、、、ブロッキングのあとそのまま抗体反応溶液でいいと思いますよ。抗体反応液に混じると何か不都合でもあるという事なんでしょうか？

ウエスタンブロットは週跨ぎで実施できる？ 削除/引用 No.11638-1 - 2023/07/21 (金) 11:00:59 - 西 ウエスタンブロッティングによるたんぱく質の検出をかなりの回数実施する予定があります。現所属では週末（土日）の作業が原則実施できないため、金曜日にSDS-PAGEから転写、ブロッキングまでを行い、メンブレンを冷蔵庫に保存したまま翌週月曜日に洗浄と1次抗体処理から再開するスケジュールだと結果に影響するか、経験談をお寄せいただけたらと思いトピックを立てました。周りに聞いてみると、オーバーブロッキングが懸念されるのでやろうと思ったことがない、という話ばかりでした。 連日作業（Day1に電気泳動、転写、ブロッキング、Day2に洗浄と1次抗体、2次抗体処理して検出）と週跨ぎ作業（Day1に電気泳動、転写、ブロッキングしたまま4度に保存、Day4あるいはDay5に洗浄と1次抗体、2次抗体処理して検出）で比較したようなご経験があればなお有難いです。よろしくお願いします。

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