全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.11604-7 - 2023/07/11 (火) 18:34:26 - asan 個人的には、NEBuilder HiFi DNA Assemblyが一番いいと思います。 1:1のクローニングなら仕様通りの量の1/4ぐらいでも十分使えるし。 HPにプライマー設計してくれるtoolもあるので、何も考えずにそれ使ってプライマーを買っても普通にできますね。

(無題) 削除/引用 No.11604-6 - 2023/07/11 (火) 16:29:29 - AA T4リガーゼも色々製品が出ていて一概にはいえませんが、大抵の場合は ・室温1−2時間 ・16度一晩 みたいなプロトコルが多いような気がします。 氷上はちょっと条件がきついのではという印象があります。 個人的な経験の話ですが、平滑末端でのライゲーションは結構効率が低いので別の方法論を取ることのほうが多いです。 in fusionやその他のシームレスクローニングでやるのは安定選択肢ではあると思います。 (私の手技の問題が大きいと思うので、平滑ライゲーションだからうまく行かない、という意味ではないです)

(無題) 削除/引用 No.11604-5 - 2023/07/11 (火) 16:07:25 - 774 Ligationの反応が長すぎませんかね。長すぎると効率が落ちるという話を以前読んだ記憶があります。 私は16度で1〜1.5時間でやってます。実験のスケジュールがあえばいいのですが。

(無題) 削除/引用 No.11604-4 - 2023/07/11 (火) 15:34:28 - おお 普通はそう言う場合大抵ライゲーションできるものです。そうするとどこで問題があったかによっては、手法を変えてもうまくいかない事はあり得ます。in-fusion するなと言う意味ではないですけど。 ゲル切り出しはUV使ってますか？ PCRはかかる条件が見つかった場合、さらに厳しい条件にしたり、場合によってはサイクル数を極力下げて泳動で感知できないような副産物を避けたりする事も一つの工夫です。 ところで こう言う場合はリン酸化されたプライマーを合成してもらう方が楽です。 もう一つ気になるのはコロニーが生えなかった事で、バックグラウンドとしてLigationされてないようなものでもいくらかはコロニーが生えてきてもおかしくないです。コンピテントはどうしてますか？ また、in-fusion でもっとコロニーが出来るとは思わない方がいいです。期待される反応でできた産物の単純比較で形質転換効率が改善しないでしょうから。ただ色々なファクターが関与するだろうから見た目in-fusion がよく生えたと言う事はあるかも知れません。

(無題) 削除/引用 No.11604-3 - 2023/07/11 (火) 14:16:44 - あ インサートとベクターのPCR産物の末端に重複部分を作って、インサートPCR産物+ベクターPCR産物をテンプレートにPCRすれば完全長の断片ができるのでそれをセルフライゲーションすれば良いと思いますが、プライマーを作り直しなのでin-fusionでやり直しても良いかと思いました。

(無題) 削除/引用 No.11604-2 - 2023/07/11 (火) 14:12:39 - 774R もし私がIn-Fusionを使えば100発100中で当たりを拾えます。というくらい楽ちんです。 平滑末端ライゲーションは多少安価で済みますが、トータルの工程を考えると大して安くならないです。 なお、インサート側のPCR産物のリン酸化は、PCR後に行うより、プライマーの段階で行った方が効率が良いし、PCR反応で勝手に不活性化するので私はこっちを推奨します。

平滑末端ライゲーションとin fusionとの比較 削除/引用 No.11604-1 - 2023/07/11 (火) 13:36:42 - iPCR いつも勉強させていただいております。 私は今、addgeneから購入したレンチウイルス用のプラスミドからあるセグメントを載せ替えたものを作製しようとしています。 具体的には受容体Xのリガンド受容部を別の受容体Yのそれに置き換えたいです。 そこで、そのプラスミドからリガンド受容部を除くような外向きプライマーを設計し、inverse PCRにより目的のPCR産物を得ました。 次に、受容体Yのリガンド受容部をPCRにて増やしました。 それぞれのPCR産物はDpn1で1時間消化後、ゲルから切り出し精製を行い、きちんと回収できていることを確認しました。 その後、ベクター側を今思えば必要なかったのですが、CIP処理し、80度2分でそれを不活化させました。 また、インサート側はPNKでリン酸化し、65度30分でそれを不活化させました。 上記二つの最終産物をT4 DNA ligaseにてライゲーションさせました（氷上で一晩）。 結果、コロニーが一つも得られませんでした。２度繰り返し実験を行い、ライゲーションの比も変えたりしましたが、だめでした。 そこでin fusionを使ったクローニングを思い浮かびました。 当方これまでに一度も使ったことがありません。 この方法では、今までの上記したものに比べて、コロニーを多く得られることが期待されるでしょうか？ 大変わかりづらい文章になっていましたら、申し訳ありません。 非常に苦しく、どうにかこの状況を打開したいです。 ご教授いただけましたら幸いです。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---