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(無題) 削除/引用 No.11600-9 - 2023/07/13 (木) 17:13:52 - たーすけ みなさまご返信ありがとうございました。 鎖置換活性、大変納得できました。 その他みなさんの議論もまた大変参考になりました。 こちらでこの議論については終了とさせていただきます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11600-8 - 2023/07/12 (水) 13:51:09 - G25 Takara以外のソース見ても普通にTaqつかっているのありますね。 私の思い込みだったようで、実は5' exo活性があっても構わない系らしい。 ということは、プローブの方に5' exoをブロックする修飾がしてるのかしらん。

(無題) 削除/引用 No.11600-7 - 2023/07/12 (水) 11:39:29 - --- >ExTaqは5'->3' exonuclease活性を欠損させた改変酵素なのでしょう え、TaKaRaはEx Taq HSを使ったProbe qPCRの酵素を販売しているのだけど。

(無題) 削除/引用 No.11600-6 - 2023/07/12 (水) 10:32:48 - G25 >ん、Taq単独でその活性ありましたっけ、Rnase HをつかったIsothermal PCRではTaqではなくわざわざ鎖交換活性があるポリメラーゼが使われるし、、、 二重鎖特異的5'->3' exonuclease活性のあるDNA polは5'->3' exonucleaseで先行鎖を分解しながら伸長を進めるのでstrand displacementはしません。逆に、5'->3' exonuclease活性のない、あるいは欠損させたDNA polは一般的にstrand displacementをします（T4 DNA polのような例外はあり）。 Taqは本来5'->3' exonuclease活性を持っていますが、TakaraがCycleave qPCRにExTaqを使っている以上、ExTaqは5'->3' exonuclease活性を欠損させた改変酵素なのでしょう（Takaraはそのことを表に出してないですが）。だって5'->3' exonuclease活性があったら原理的にCycleave qPCRは成立しないはずだもの。 で、5'->3' exonuclease活性を欠損させたら代わりにstrand displacementをするようになるというのはあるでしょう。Klen Taq (NEB)やDNA pol I Large fragment (Klenow fragment)のように。 https://international.neb.com/tools-and-resources/selection-charts/dna-polymerase-selection-chart ちなみにExTaqは校正活性を持たせるためにPwo polが添加されてるようでwす（これもTakaraは積極的には表に出していないけど）。

(無題) 削除/引用 No.11600-5 - 2023/07/12 (水) 09:58:00 - おお >[Re:4] Ggrさんは書きました : > >[Re:3] たーすけさんは書きました : それもそうですが、そもそもDNApolに鎖置換活性があるため、切断の有無に関係なく伸長反応とともにプローブは解離します。 > ん、Taq単独でその活性ありましたっけ、Rnase HをつかったIsothermal PCRではTaqではなくわざわざ鎖交換活性があるポリメラーゼが使われるし、、、 Each INAAT utilizes specific enzymes and reaction conditions, but all require polymerases with strand-displacement activity. DNA polymerases, such as Bst DNA Polymerase, Klenow exo-, and Phi29 (EquiPhi29) exhibit rapid and strong strand displacement activity, and are suitable for isothermal nucleic acid amplification. https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/pcr/isothermal-nucleic-acid-amplification.html Taqは弱いけどあるってことですかね、、、それともタカラのCycleave qPCRきキットの内容みるとExTaqHSつかってるけど、これってTaqになんか混ぜ物があるんでしたっけ、、、

(無題) 削除/引用 No.11600-4 - 2023/07/12 (水) 07:48:11 - Ggr >[Re:3] たーすけさんは書きました : > 私の認識としては、断片が二つになり短くなったことで、Tm値が低くなり、自然と乖離したという認識なのですが、あっているでしょうか？ それもそうですが、そもそもDNApolに鎖置換活性があるため、切断の有無に関係なく伸長反応とともにプローブは解離します。

(無題) 削除/引用 No.11600-3 - 2023/07/11 (火) 17:35:26 - たーすけ Ggrさん、ご返信ありがとうございます！ すみません、 エキソヌクレアーゼ活性を欠いているということは、RNaseによる一塩基が切断された二つの断片は、どのようにして乖離するのでしょうか？ 私の認識としては、断片が二つになり短くなったことで、Tm値が低くなり、自然と乖離したという認識なのですが、あっているでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11600-2 - 2023/07/11 (火) 08:11:35 - Ggr 単純です。 exonuclease活性を欠いている耐熱性DNAポリメラーゼを使用しているためです。 https://doi.org/10.1016/j.diagmicrobio.2013.12.002

Cycleave qPCR 削除/引用 No.11600-1 - 2023/07/10 (月) 18:04:57 - たーすけ Cycleave qPCRの原理について疑問に思っていることがあります。 どうぞよろしくお願いいたします。 Taqmanprobe法によるqPCRは、エキソヌクレアーゼ活性のあるtaqが、アニールしたプローブを分解することで、蛍光色素とクエンチャーが分離して蛍光を発するかと思います。 Cycleave qPCRは、一塩基のRNAがアニールした場合、RNaseで切断され、蛍光を発するという説明がありますが、RNaseによって切断されようがされまいが、エキソヌクレアーゼ活性によってプローブは分解されるのではないでしょうか。 お分かりになる方、お教えください。 よろしくお願いいたします。

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