BioTechnicalフォーラム [mRNA抽出・DNase処理後のDNase不活化]

mRNA抽出・DNase処理後のDNase不活化

No.11593-TOPIC - 2023/07/07 (金) 16:13:00 - ak

お世話になっております。

バクテリアのmRNAのqPCRを行うため、mRNA抽出後にDNase処理が必須なのですが、
DNaseをどのように不活化or除去するのが最適でしょうか。
できることならフェノクロ→エタ沈ではなくて
加熱で不活化できれば簡単なのですが、75℃、10 minにRNAは耐えられるのでしょうか。
ご経験のある方がいらっしゃいましたらご教示いただけますと幸いです。

よろしくお願いします。
　

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(無題)

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No.11593-9 - 2023/07/10 (月) 10:07:45 - おお

>[Re:8] 2MEさんは書きました :

> TRIzol処理でDNAの混入が生じる原因は、
> ・ホモジナイズに使用したTRIzol試薬1が少なすぎた。
> ・サンプルが、有機溶媒（エタノール、DMSO等)、または強いアルカリ性溶液を含有していた。
>

私は定性的なPCRもTRizol（いまはRNAZol）でやってきたという経緯もあり、出ると困ることもよくあったのでDNase処理は大抵はやっていました。やらないと必ずといいほどバンドがでます。経験上無視できる量という事ならそれでいいのだと思いますが、実験やターゲットによってｃDNAとコンタミのDNAの割合が変わるかもと思うとちょっと気持ち悪いです。

> 核酸量の多いサンプルの場合、TRIzol量を適宜増やすとよいでしょう。
>
> > Trizol→DNase→もう一度Trizol
> > したところ、non-RT群のCq値がほぼネガティブになりました。
>
> それはよかったですね。
> その場合、DNase処理による効果もあるでしょうが、TRIzol処理を2回行ったことによる効果も考えられます（他者のコメントが示唆するように）。
>

DNase処理後さらにもう一度Trizolなどで精製というのはのよくやるプロトコールです。DNaseで消化しきれなくアンプリコンの部分が残ったとしてもTrizoｌなどで除けることも期待しています。ですからDNase処理はそんなに厳密に通常のプロトコール通りしていません。On Iceで５分ぐらいとか。また私のやる実験で発現ベクターを導入して、その転写産物のプロセッシングを見るといったこともよくあり、この場合導入したベクターはゲノムに比べると相当多いコピー数になっていてTrizoｌだけでは除去が追い付かなかったりもします。

(無題)

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No.11593-8 - 2023/07/09 (日) 06:08:08 - 2ME

>[Re:7] akさんは書きました :
> Trizol法でもDNase処理なしだとバチバチにgDNAがコンタミしてました。(non-RT群でRT群の1/4 - 1/8位のCq値になる。ネガティブとは程遠い)

TRIzol処理でDNAの混入が生じる原因は、
・ホモジナイズに使用したTRIzol試薬1が少なすぎた。
・サンプルが、有機溶媒（エタノール、DMSO等)、または強いアルカリ性溶液を含有していた。

可能性があります。
（TRIzol プロトコルのトラブルシューティングの項に記載してあります。尤も、Chomczynski法の原理を理解している人ならば誰でも考えつくことでしょうが）。

核酸量の多いサンプルの場合、TRIzol量を適宜増やすとよいでしょう。

> Trizol→DNase→もう一度Trizol
> したところ、non-RT群のCq値がほぼネガティブになりました。

それはよかったですね。
その場合、DNase処理による効果もあるでしょうが、TRIzol処理を2回行ったことによる効果も考えられます（他者のコメントが示唆するように）。

ご武運を祈ります。

ご回答いただきありがとうございました。

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No.11593-7 - 2023/07/08 (土) 23:46:03 - ak

皆様

ご回答いただきありがとうございました。

ほとんどの原核生物はイントロンがないのでgDNAの混入は良くない/primerの設計ではどうにもならない、という前提のもとで実験結果を軽く共有させてください。

Trizol法でもDNase処理なしだとバチバチにgDNAがコンタミしてました。(non-RT群でRT群の1/4 - 1/8位のCq値になる。ネガティブとは程遠い)

Trizol→DNase→もう一度Trizol
したところ、non-RT群のCq値がほぼネガティブになりました。

アドバイスいただきありがとうございました。

(無題)

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No.11593-6 - 2023/07/08 (土) 12:23:17 - 2ME

>[Re:5] ponさんは書きました :
> 横から質問で恐縮ですが、皆様、遺伝子発現解析目的のRNA抽出やその後の逆転写の際のDNase処理はどれぐらい必須と考えておられますか？
> 例えばqRT-PCRでイントロンを挟んだPCRしか行う予定が無いのであれば基本的に不要だし、もっと強く言うとやらなくて良いのであればやらない方が良いと行って良いでしょうか？

RNA抽出にDNase処理すべきか否かは、研究目的や実験手法によるとしか言いようがありません。やらずに済むならやらない方がよいというのは一理あると思います。

ちなみに私はTRIzolすなわちChomczynski法（AGPC法）を用いることがほとんどです。この場合は私はDNase処理はしません。Chomczynski法ではRNAとDNAの分離が可能です。もちろん100:0の分離とはなりませんが。

劇物指定のせいか、フェノールを嫌ってChomczynski法を使わない人が一定数おられるようです。RNAにおけるDNAの混入が無視できない問題であると考えるなら、Chomczynski法でRNA抽出をするのも一つの考え方です。

(無題)

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No.11593-5 - 2023/07/08 (土) 10:41:24 - pon

横から質問で恐縮ですが、皆様、遺伝子発現解析目的のRNA抽出やその後の逆転写の際のDNase処理はどれぐらい必須と考えておられますか？

例えばqRT-PCRでイントロンを挟んだPCRしか行う予定が無いのであれば基本的に不要だし、もっと強く言うとやらなくて良いのであればやらない方が良いと行って良いでしょうか？
イントロンを挟めないPCRの際は「必須」でしょうか？
また、RNAシーケンスを行う場合はDNase処理は必要でしょうか？

(無題)

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No.11593-4 - 2023/07/08 (土) 08:40:16 - G25

RT-PCRの前処理用のDNase製品がありますから、そういうのを利用したらいいのではないでしょうか。
RNase-freeであるだけでなく、処理後の失活にも配慮されています。

例えば、
ttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18068015

ttps://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/dnase1/dnase-heat-stop.html

あるいは、RT-qPCR用の逆転写キットにgDNA除去用のDNase処理が組み込まれている製品もあります。DNase処理からRTに移行するのに最適化されたバッファー系になっていたりします。

ttps://lifescience.toyobo.co.jp/detail/detail.php?product_detail_id=10

ttps://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100006536

何れにせよ、熱処理はRNAの分解を招く危険性がありますから大雑把にやっていはいけません。

DNaseの活性にはMg++、Ca++が必要なので反応バッファーに入っています。
しかし、二価金属イオンは触媒として働き、高温下でRNAを加水分解します。
EDTAでキレートすると防止できますが、次のPCRを阻害する可能性があります。
DNA除去とRNAの保全性やPCR反応は多かれ少なかれトレードオフになります。
RT-PCRの前処理用のDNase製品はそのへんの塩梅が工夫されています。

(無題)

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No.11593-3 - 2023/07/08 (土) 08:31:14 - 2ME

RNAは二価陽イオンの存在下で加熱すると化学分解（非酵素的分解）を起こすことが知られています。

DNase反応バッファーには二価陽イオンが含まれているので、mRNAサンプルをDNase処理後にそのまま加熱するとmRNAは分解します。

分解の程度は、RNA量、イオンの種類や量、反応バッファーの種類、温度、その他の要因によって異なります。また、その分解の程度を無視できると判断するかどうかは、実験目的に依存することでしょう。

もちろん、37℃でもRNAは分解はします。ただし37℃30分のDNase処理によって分解されるRNA量はごくわずかであり、通常のRT-PCRやqPCRでは問題視していないものと思われます。

RNAをDNase処理後にそのまま75℃、10 minの操作を行えば、RNAは分解されると考えられます。しかしながら実験目的によっては、その分解を許容できるかもしれません。それは質問者が判断することです。

フェノール処理を望まないのであれば、たとえば、バッファー交換した後に加熱処理をするという方法が考えられます。

ちなみにThermo Fisherからは以下のような商品が売られています。ご参考までに。
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM1907

(無題)

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No.11593-2 - 2023/07/08 (土) 01:10:57 - おお

mRNA精製をもう一度繰り返すっていう手がありますね。

mRNA抽出・DNase処理後のDNase不活化

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No.11593-1 - 2023/07/07 (金) 16:13:00 - ak

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