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(無題) 削除/引用 No.11591-12 - 2023/07/09 (日) 08:54:59 - Skeptic 細胞外領域に結合する分子を探すことと細胞内領域に結合する分子を探すことはかなり方向性の違うプロジェクトだと思うのですよね。生理的機能について何もわかっていない分子だから、この分子についてどんなことでもいいから知りたいということなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11591-11 - 2023/07/09 (日) 08:33:14 - おお >[Re:10] あああさんは書きました : > full length-flag, ECD-flag, ICD-flag (or flag-ICD)の３通りを作ったらどうでしょうか。 TNFRSFはたしか３量体になったりするのでドメインを分けたいならその辺をどうするのかまで考えないといけないかもですね。

(無題) 削除/引用 No.11591-10 - 2023/07/07 (金) 16:53:24 - あああ full length-flag, ECD-flag, ICD-flag (or flag-ICD)の３通りを作ったらどうでしょうか。 全長は可溶化しないといけないですが多量体化するなら全長も入れたほうが入れたほうが良いように思いました。

(無題) 削除/引用 No.11591-9 - 2023/07/07 (金) 15:28:32 - UTR TNFRSFで、N末がリガンド側、C末が細胞内になります。 あまり研究が進んでいないTNFRSFがターゲットになります。

(無題) 削除/引用 No.11591-8 - 2023/07/07 (金) 10:49:31 - あああ その膜タンパク質が属するファミリー、か大まかな構造は書かないと具体的なコメントは来ないと思います。 例えば１回膜貫通のレセプター（サイトカインやTNFSFRだとか、複数膜貫通のファミリー(SLCとかGPC)だとか。それ位は書いてもいいんじゃなですか。

(無題) 削除/引用 No.11591-7 - 2023/07/07 (金) 09:08:24 - み >[Re:3] UTRさんは書きました : > シグナルペプチドをfull lengthに不可する必要はあるのでしょうか。 > 人によっては全く気にしていないのですが。 当該膜タンパクがどのような配列から成っているかによりますね。 > また、可溶化するバッファーとかどうされますか。 当該膜タンパクがじゅうぶん可溶化されて且つ相互作用タンパクが解離しない条件でやりますね。

(無題) 削除/引用 No.11591-6 - 2023/07/07 (金) 03:27:47 - おお >[Re:1] UTRさんは書きました : > > シグナルペプチド-Flag-膜タンパク質にしようと思っているのですが、 ちょっと気になったのですが、 この場合シグナルペプチドーFLAG−その膜タンパクのシグナルペプチドを除いた配列 にしないとダメでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.11591-5 - 2023/07/07 (金) 03:22:49 - おお ＞シグナルペプチドをfull lengthに不可する必要はあるのでしょうか。 生化学とかBiologyのテキストで膜タンパクについてまず読んでください。内在性のものはシグナルペプチドがついてないと考えるなら、なんで膜で発現しているのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11591-4 - 2023/07/07 (金) 03:18:31 - おお >[Re:1] UTRさんは書きました : > 1.プラスミドの作成に、Flagタグを使おうと思っています。full lengthでco-IPを行う場合は、シグナルペプチド-Flag-膜タンパク質にしようと思っているのですが、正しいのでしょうか。 余計なおせっかいかもしれませんが、正しいかどうかという聞き方はやめたほうがいいと思います。言えることは、そういう方法論は存在しますしあり得るやり方だという事です。一般論という言い方は使いたくないですが、膜タンパクは特にC末にタグを入れることが多いです。N末はシグナルペプチドとの兼ね合いでコンストラクションに手間がかかることがある（さがせばシグナルペプチドーTag−MCSのようなベクターも売っているか手に入るでしょうから、その場合は手間がかかるとまでは言いませんけど）。あとFLAGはネガティブにチャージしたアミノ酸が多いのでトポロジーを乱す可能性があります。C末の膜貫通ドメインからなるべく離したところに置きたいという事もあると思います。無難なのはデザインした配列でTopology予測の計算をさせて、もともとのタンパクと変わらないか確認するという事。とくにお示しのようなコンストラクトの場合。 > > 2.膜タンパク質は、細胞内ドメインと細胞外ドメインに分かれるので、別々にco-IPを行った方がいいのでしょうか。誰に質問してもfull-lengthは簡単ではないから、やめた方がいいと言われます。 > full-lengthは簡単ではないという話は私にはよくわかりません（プラスミドを細胞に導入してそこから抽出する場合）。何を見るのかにもよりますが、膜タンパク同士のInteractionは膜貫通ドメインも関与している可能性が高いです。ドメインを分けてしまうとよくわからないファクターが加わり何を見ているのかわからなくなる可能性を考えてしまいます。たとえば細胞内のドメインをどのように発現させるのか。ERを介したタンパク合成とサイトゾル内でのタンパク合成で何か違いがでないか？局在も変わってきて大丈夫か？解析であまり局在的に関係なさそうな核内のタンパクが見つかったとき、全長であれば上記のような心配が大きくなりますが、全長であればまだそういうたぐいのアーティファクトは除外できます。 たぶん全長でProteomicsをしている研究は結構あると思いますよ。自身で調査してみたらどうですか？

(無題) 削除/引用 No.11591-3 - 2023/07/07 (金) 02:14:11 - UTR シグナルペプチドをfull lengthに不可する必要はあるのでしょうか。 人によっては全く気にしていないのですが。 また、可溶化するバッファーとかどうされますか。

(無題) 削除/引用 No.11591-2 - 2023/07/06 (木) 23:44:10 - み 自分ならまずはＣ末タグのfull lengthでやるわ。 何がどう難しいのか知らんけど。 今どきのCoIP産物をマス解析で同定する方法なら感度も良いし量的にもそないにいらんし。 変なノイズや非特異結合をなるべく避ける努力をした方が良い。 可能なら安定細胞株でトライするかな。 細胞外と細胞内に分かれるとはどういうことですか？ 膜貫通領域を挟んで分かれるということなら全長でやるのが一番良いと思う。局在化や蛋白のターンオーバーやリガンドと結合することが引き金となって細胞内ドメインの制御が動くなど生理的に結合しそうな物を取るとき色々考えた方が良い。 接着分子、受容体とか何か予想される機能があるだろうに。 まあ使用するホスト細胞の選定か一番重要やろな。

膜タンパク質に結合するタンパク質の同定 削除/引用 No.11591-1 - 2023/07/06 (木) 23:02:13 - UTR 膜タンパク質に結合するタンパク質の同定を行いたいと考えているのですが、一般論として、どういう実験デザインにするのか、非常に悩んでおります。 1.プラスミドの作成に、Flagタグを使おうと思っています。full lengthでco-IPを行う場合は、シグナルペプチド-Flag-膜タンパク質にしようと思っているのですが、正しいのでしょうか。 2.膜タンパク質は、細胞内ドメインと細胞外ドメインに分かれるので、別々にco-IPを行った方がいいのでしょうか。誰に質問してもfull-lengthは簡単ではないから、やめた方がいいと言われます。

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