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(無題) 削除/引用 No.11586-20 - 2023/07/08 (土) 22:55:02 - df 長いことDAPIは封入剤に混ぜてます。なので未反応のDAPIは標本上にそのまま残っているわけですが、バックグラウンドが上がるとかはないです。ほぼ核だけ綺麗に染まり、冷蔵庫で１週間くらい放置してても綺麗なままです。実際、DAPI入り封入剤とかも売ってましたし買ってました。今あるかどうか知りません。今はお金ないので自分で作ってます。 なのでDAPI反応後に洗うとかはしたことないし聞いたことないです。

(無題) 削除/引用 No.11586-19 - 2023/07/07 (金) 17:14:39 - けい 下記、お答えの続きです。 重ね重ねですが、御礼申し上げます。 >[Re:17] ゴムゴムの木さんは書きました : > 作業順序的に「DAPIが固定」されるわけではないように思いますよ。 > 固定されるのは基本的に細胞内に存在していた生体物質であって、DAPIと核酸の化学固定はフリーのアルデヒド基とかがそれなりにあるのであればという条件がつくと思います。 ゴムゴムの木さま コメントをいただき、ありがとうございます。 DAPIはDNAにインターカレーションしてはまり込むような状態で存在すると思います。 なので（他の方もご指摘のように）DAPI自体の解離以外にも固定不良・透過処理の過剰による核酸自体の流出も考慮すべきかもしれません。 いずれにせよ、固定や透過処理条件の調節といった手段になりそうですが...。 >[Re:16] ドガさんは書きました : > 単純な化学平衡の話ですよ。 > DNAにBindしたDAPIが出来たあとに、洗浄してFreeのDAPIを除けば、今度はFreeのDAPIが増えるように平衡が移動する。 > その移動を止める為に固定するが、平衡が移動したなら固定がまずかったって事。 > 各工程の意味を理解していない証拠。 ドガさま コメントをいただき、ありがとうございます。 結合と解離の反応を考慮し、（一旦は結合しているようですので）解離側に傾かないように条件を検討します。 固定がまずければ核酸自体も断片化されたり、核から漏れたりする可能性もあるかもしれません。 まずは条件検討として透過処理、また固定処理の内容を見直してまいります。 >[Re:14] totoさんは書きました : > PFA固定が短かすぎると思いますよ。このため、他の方がいわれてるようにDNAが切れて核からでてきてるのでしょう。10分だと細胞は死にますが、分子間架橋はあまりできません。電気泳動したらわかります。 totoさま ご指摘いただき、ありがとうございます。 固定の時間について透過処理と同様に検討いたします。 本来の目的の免疫染色の染まりに変化がないか、気になるところですが、個別に調べてみます。 >[Re:13] ---さんは書きました : > 退色防止剤の組成によってはDAPIの脱色（退色ではない）が早く進む場合があります。 > 退色防止剤にDAPIを加えるやり方もあります（最初から添加されている退色防止剤も売られている）。 ---さま 情報をいただき、ありがとうございます。 DAPIの脱色については初耳でした。 検討の結果いかんでは、ご提示されたDAPI添加済みの退色防止剤（もしくは双方含んだ封入剤）などを検討したく思います。

(無題) 削除/引用 No.11586-18 - 2023/07/07 (金) 17:07:27 - けい 多くのご指摘をいただき、誠にありがとうございます。 各点につきまして下記の通りお答えいたします。 >[Re:12] ゴンタさんは書きました : > 他の回答者さんの記述を見て思いました。EtBrのようなキレーターも染色後、H2Oバックグラウンドの溶液に放置すると色が抜けていきますね。最初は染まって、後で拡散ということを考えるとこの辺と関係しているのかなと思います。 > ＊核膜がスカスカになりすぎている > ＊DNAが断片化しており、「スカスカ」の核膜から細胞質へ漏出 > （固定が不十分であればこの現象は促進される方向に働くようにも思います） ゴンタさま コメントをいただき、ありがとうございます。 EtBrの件、類似した現象ということで参考になります。 とりあえず一旦は染まるということで、DNAへの結合後に解離・拡散してしまう、もしくはDANが漏れると考え、固定や透過処理などサンプルの核膜などの状態を変化させる工程の検討が必要と考えているところです。 >[Re:11] 2MEさんは書きました : > 質問者がご自分で指摘されているとおり、DAPIの漏れの可能性が考えられます。 > 以下の点を検討されてはいかがでしょうか（他のコメントと重複します）。 > 1. DAPI濃度を下げる。および／またはDAPIの洗浄を厳しくする。 > 2. 固定化条件を緩くする。 > 3. 透過処理条件を緩くする。 2MEさま ご助言をいただき、ありがとうございます。 まずはDAPI以外の試薬も完全に再調整したうえで、漏れの原因となり得る透過処理の条件検討から行ってみようと思います。 >[Re:10] AAさんは書きました : > 細胞染色ではなくて組織染色の話ですが、蛍光のin situ hybridizationの対比でDAPIを染めようとするとうまく染まってくれません。まさに > >核がぼやけ、細胞質も薄く青色で染まったDAPI染色像になります。 > 同じDAPI溶液で普通の免疫染色などでは問題なく核を染められるので、やはりサンプル側の状態次第で染まらなくなることがあるんじゃないかと思います。 > じゃあ原因がなにか、と言われると非常に難しいのですが。。。 AAさま 経験を御共有いただき、ありがとうございます。 私も同じ組成のDAPIで免疫組織化学も行っていましたが、ここまで顕著なDAPIの退色（漏れ？）は未経験なところです。 AAさま同様に、（IFでの固定や透過処理の過不足などにともなう）サンプル側の問題のように思えます。 >[Re:9] ゴンタさんは書きました : > 一つ思うことがあるとすれば、マウントする際にある程度水気を取らないと（私は綿棒で撮っています）硬化するmount剤でももちろん希釈され硬化しなくなります。その辺は大丈夫ですか？ ゴンタさま マウント時の注意点について、ご助言をいただき、ありがとうございます。 水気についてはワイプに落としてマウントしています。 乾燥後は硬化しているようです。

(無題) 削除/引用 No.11586-17 - 2023/07/07 (金) 09:33:34 - ゴムゴムの木 作業順序的に「DAPIが固定」されるわけではないように思いますよ。 固定されるのは基本的に細胞内に存在していた生体物質であって、DAPIと核酸の化学固定はフリーのアルデヒド基とかがそれなりにあるのであればという条件がつくと思います。

(無題) 削除/引用 No.11586-16 - 2023/07/07 (金) 09:29:22 - ドガ 単純な化学平衡の話ですよ。 DNAにBindしたDAPIが出来たあとに、洗浄してFreeのDAPIを除けば、今度はFreeのDAPIが増えるように平衡が移動する。 その移動を止める為に固定するが、平衡が移動したなら固定がまずかったって事。 各工程の意味を理解していない証拠。

(無題) 削除/引用 No.11586-14 - 2023/07/06 (木) 18:58:02 - toto PFA固定が短かすぎると思いますよ。このため、他の方がいわれてるようにDNAが切れて核からでてきてるのでしょう。10分だと細胞は死にますが、分子間架橋はあまりできません。電気泳動したらわかります。

(無題) 削除/引用 No.11586-13 - 2023/07/06 (木) 18:00:50 - --- 退色防止剤の組成によってはDAPIの脱色（退色ではない）が早く進む場合があります。 退色防止剤にDAPIを加えるやり方もあります（最初から添加されている退色防止剤も売られている）。

(無題) 削除/引用 No.11586-12 - 2023/07/06 (木) 14:28:50 - ゴンタ 他の回答者さんの記述を見て思いました。EtBrのようなキレーターも染色後、H2Oバックグラウンドの溶液に放置すると色が抜けていきますね。最初は染まって、後で拡散ということを考えるとこの辺と関係しているのかなと思います。 ＊核膜がスカスカになりすぎている ＊DNAが断片化しており、「スカスカ」の核膜から細胞質へ漏出 （固定が不十分であればこの現象は促進される方向に働くようにも思います）

(無題) 削除/引用 No.11586-11 - 2023/07/06 (木) 14:16:12 - 2ME 質問者がご自分で指摘されているとおり、DAPIの漏れの可能性が考えられます。 以下の点を検討されてはいかがでしょうか（他のコメントと重複します）。 1. DAPI濃度を下げる。および／またはDAPIの洗浄を厳しくする。 2. 固定化条件を緩くする。 3. 透過処理条件を緩くする。

(無題) 削除/引用 No.11586-10 - 2023/07/06 (木) 13:24:40 - AA 細胞染色ではなくて組織染色の話ですが、蛍光のin situ hybridizationの対比でDAPIを染めようとするとうまく染まってくれません。まさに >核がぼやけ、細胞質も薄く青色で染まったDAPI染色像 になります。 同じDAPI溶液で普通の免疫染色などでは問題なく核を染められるので、やはりサンプル側の状態次第で染まらなくなることがあるんじゃないかと思います。 じゃあ原因がなにか、と言われると非常に難しいのですが。。。

(無題) 削除/引用 No.11586-9 - 2023/07/06 (木) 08:52:00 - ゴンタ ちょっと自信はないですが、私が経験したことが原因だと仮定してつらつら考えてみますと、、。 DAPIは「H2O」バックグラウンドの溶媒だと核酸から解離しやすくなるのかな、、、。 とすると、マウント剤が固化するタイプと固化しないタイプで差はないか、、、。ちなみにfluoromount硬化しますね、、、。DAPI入りmount剤もありますが、多分固化するタイプも固化しないタイプもありますよね、、、。そうするとちょっと私の考えは間違っているかな、、、。 一つ思うことがあるとすれば、マウントする際にある程度水気を取らないと（私は綿棒で撮っています）硬化するmount剤でももちろん希釈され硬化しなくなります。その辺は大丈夫ですか？

(無題) 削除/引用 No.11586-8 - 2023/07/05 (水) 11:26:47 - けい あの様 下記のコメントに対するお答えをしておりませんでした。 多々コメントをいただき、誠にありがとうございます。 お答えについて下記の通りです。 >[Re:5] あのさんは書きました : > それからDAPIと、蛍光標識二次抗体を混ぜても問題ないです。 > 封入剤は何ですか？ Fluoromountです。 >[Re:4] あのさんは書きました : > プロトコルを拝見しての印象です。 > > 組織でなくて細胞なら、PFAやTritonの処理時間は、１分前後で良いと思います。 > 同じ細胞を染色した経験はありませんが、違和感を当方は感じます。 > 直接の対策になるかどうかはわかりませんが。 > それから観察は、共焦点顕微鏡ではなく、普通の蛍光顕微鏡ですね？ 上記ご助言を承知いたしました。 固定や透過処理の時間について、検討しようと思います。 観察は通常の蛍光顕微鏡です。

(無題) 削除/引用 No.11586-7 - 2023/07/05 (水) 11:17:05 - けい >[Re:6] あのさんは書きました : > おっと、ブロッキングのステップが無いですね。 > > BSAがそのつもりなら、第一抗体を使う前に、ブロッキング剤だけのステップが必要です。 あの様 コメントをいただき、ありがとうございます。 ご指摘の通りだと思います。 現在、前任者の方法に準じて実験を行っているところです。 今のところ高バックグラウンドや非特異的と思われる染色像を認めていないので、方法を変更せず行っています。 （自分ではブロッキングの有無による染色の差異を確認していません） あの様のご指摘のように、潜在的な非特異的な染色の防止におけるブロッキングの重要性は無論のことと思いますので、ブロッキングの有無による染色像の違いについては、今後実際に自身の手で確認したく思います。

(無題) 削除/引用 No.11586-6 - 2023/07/04 (火) 23:45:14 - あの おっと、ブロッキングのステップが無いですね。 BSAがそのつもりなら、第一抗体を使う前に、ブロッキング剤だけのステップが必要です。

(無題) 削除/引用 No.11586-5 - 2023/07/04 (火) 23:43:01 - あの それからDAPIと、蛍光標識二次抗体を混ぜても問題ないです。 封入剤は何ですか？

(無題) 削除/引用 No.11586-4 - 2023/07/04 (火) 21:22:08 - あの プロトコルを拝見しての印象です。 組織でなくて細胞なら、PFAやTritonの処理時間は、１分前後で良いと思います。 同じ細胞を染色した経験はありませんが、違和感を当方は感じます。 直接の対策になるかどうかはわかりませんが。 それから観察は、共焦点顕微鏡ではなく、普通の蛍光顕微鏡ですね？

(無題) 削除/引用 No.11586-3 - 2023/07/04 (火) 19:47:41 - けい >[Re:2] ゴンタさんは書きました : > DAPIはメタノールとかで希釈していると思いますが、これをworking sol的にPBSで薄めたものを準備し保存した場合、「持ち」が悪くなります（確か一月ほどで不具合が出たような、、、）。 ゴンタ様 コメントをいただき、ありがとうございます。 希釈後の比較的低濃度での保存が劣化につながるとの事、参考になります。 ただ、ご指摘のような保存による劣化を考慮し、新規購入したDAPI水溶液を用事希釈した染色液、元から保存してあったDAPIを用いた染色液の双方による染色を比較しましたが改善には至りませんでした。 （使用期限が担保されている物を、と愚考しメーカー作製の水溶液を試してみた、というところです。） 製品自体はメタノール希釈のものではありませんので、その点留意する必要があると考えております。

(無題) 削除/引用 No.11586-2 - 2023/07/04 (火) 16:52:45 - ゴンタ DAPIはメタノールとかで希釈していると思いますが、これをworking sol的にPBSで薄めたものを準備し保存した場合、「持ち」が悪くなります（確か一月ほどで不具合が出たような、、、）。具体的な症状としては細胞質が染まるような染色像でけいさんが遭遇している状況に一致しているように思います。

ImmunofluorescenceでのDAPI染色不良 削除/引用 No.11586-1 - 2023/07/04 (火) 16:22:34 - けい いつもお世話になっております。 Immunofluorescence (IF)で核の対比染色にDAPIを使っています。 封入直後は、核の形で正常なDAPIの染色像が観察できるのですが、次の日（十数時間以降）以降に観察すると、核がぼやけ、細胞質も薄く青色で染まったDAPI染色像になってしまい、困っています。 （時間をさらにおくと核すらハッキリ確認できなくなります） 遮光や長時間の露光回避など退色には留意しているつもりで、蛍光標識抗体による染色の観察には問題ありません。 また、DAPIそのものについても買いなおしましたが、同様の事象を認めています。 一旦DNAに結合したDAPIが解離し、細胞質などに漏れでているような印象をもっていますが、類似の事象やそれに対する対処のご経験などがありましたらご教示いただければと存じます。 プロトコルについては下に簡単に示します。 固定や透過処理など、なにか問題点がありましたらご指摘いただけますと幸甚です。 よろしくお願い申し上げます。 細胞：マウスマクロファージ PBSで2回Wash ↓ 4 % パラホルムアルデヒドで固定（室温 10分） PBS で細胞を 1回洗浄 ↓ 0.1 % Triton X-100を含むPBSで、10分間透過処理 PBS で、5分間 3回洗浄 ↓ 1 % BSA/PBS で希釈した一次抗体で、室温 1時間反応 PBS で、5分間 3回洗浄 ↓ 以降遮光 1 % BSA/PBSで希釈した蛍光標識二次抗体で、室温 1時間反応 PBS で、5分間 3回洗浄 ↓ 1 μg/mLの DAPIを含むPBSで、10分間反応 PBS で1回5分間洗浄 ↓ 蛍光染色用封入剤で封入 4 ℃遮光保存

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