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SYBR master様お返事ありがとうございます。 削除/引用 No.11583-4 - 2023/07/06 (木) 10:59:09 - nb SYBR master様お返事ありがとうございます。 やはり、コロニーが生えるのはおかしいですよね。。。 HR以前の問題として、Cas9による切断が起こっていないかもしれません。 Cas9の発現をまずはmRNAレベルで調べてみます。 gRNAの発現のcheck法があればご教示いただけますと幸いと存じます。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11583-3 - 2023/07/04 (火) 21:37:43 - SYBR master 基本的に行ったことが無い実験ですが、知っている範囲内で。 >[Re:1] nbさんは書きました : > 【懸念点】 > 5. Cas9による切断が起こっているか？→操作3で意外とたくさんのコロニーが生えてくる。ゲノムDNAが切断されっぱなしでNHEJやHRによる修復がないと死滅する気がするのですが。。。死滅しないでたくさんのKOじゃない株が生えてくるのはおかしいでしょうか。 そもそも、原核微生物は非相同末端結合(non-homologous end-joining:NHEJに関連するDNPK-csやLigaseIVさらにKuも持っていないので）が無いか、有っても非常にごく希な微生物のみです(NHEJ関連タンパク質のkuを持っているやつが居ると聞いたことがあります)。したがって相同組み換え(homologous recombination; HR)が起きない限り、ゲノムが切断されたままですので、死滅するのが一般的に考えられています。 > 6. 相同組み換えが起こっていないのでは？→Exonucleaseが働いているか？→Homology armの5'はリン酸化されている必要がありますか？現状、ただのPCR産物です。 BET(Beta-recombinase)はssDNA結合タンパク質です。dsDNAには基本くっつかないと考えて良いと思います。lambda Redの5'→3'exonucleaseの特性についてはよく解らないですが、REDの説明図にはリン酸化の有無は示されていませんので、必要ないのかもしれません。一方で市販されているlambda exoは5'リン酸化が必要な酵素ですが、同じモノかどうかは知りません。ただ、働いていないとするとBETを介した相同組み換えは、メカニズム上起きえないです。 基本的にLmabda REDとCas9を利用したHRは、予想以上に効率は良くないみたいですね。そもそもCas9の発現量とsgRNAの転写量が最適化されていないため(sgRNA量>Cas9量)、Cas9の切断効率そのものが悪いのでは無いか、という考察を聞いたことがあります(卒論や修論では無く、たぶん学会発表です）。そのため、HRが起きたときのみにセレクションが掛かるように、Amp耐性遺伝子等を組み込んで居るようです。 >[Re:2] nbさんは書きました : > すみません。タイトルを間違えてしまいました。 > RecBCDではないです。。。 ですね。システムの説明には良く出てきますが。

(無題) 削除/引用 No.11583-2 - 2023/07/04 (火) 08:52:55 - nb すみません。タイトルを間違えてしまいました。 RecBCDではないです。。。

Crispr/Cas9による大腸菌KO作成におけるRecBCDの重要性 削除/引用 No.11583-1 - 2023/07/04 (火) 08:47:53 - nb Crispr/Cas9で大腸菌のKOを作成したいのですが、うまくいっておらず、 相同組み換え反応らへんで不具合が生じていそうな予感はしているのですがポイントを確定させることができずに困っております。 ご助言いただけますと幸いと存じます。 【問題なく進行しているポイント】 1. Cas9とlambda redシステム(5'→3'exonucleaseやBeta recombinase)がコードされたのpCas(addgene 62225)を大腸菌にHeat shockで導入した。 2. gRNAがコードされたpTarget(addgene 62226)を大腸菌に電気穿孔で導入した。 　　　　この際、同時にHomology armも導入した。 【不具合が生じているポイント】 3. 操作2後の大腸菌を選択培地に塗布すると生えてくるので、両プラスミドとも保持しているのは間違いないのだが、生えてくるコロニーにKO株が全くない。 【懸念点】 4. 必要なタンパク質(Cas9とlambda redシステム)が発現しているか？→RTqPCRで確認中 5. Cas9による切断が起こっているか？→操作3で意外とたくさんのコロニーが生えてくる。ゲノムDNAが切断されっぱなしでNHEJやHRによる修復がないと死滅する気がするのですが。。。死滅しないでたくさんのKOじゃない株が生えてくるのはおかしいでしょうか。 6. 相同組み換えが起こっていないのでは？→Exonucleaseが働いているか？→Homology armの5'はリン酸化されている必要がありますか？現状、ただのPCR産物です。 以上になります。 特に6の不安点についてご助言いただけますと幸いと存じます。 また、その他、気をつけなくてはいけないポイントがございましたらご助言いただけますと幸いと存じます。 よろしくお願いします。

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