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(無題) 削除/引用 No.11582-10 - 2023/07/05 (水) 06:09:52 - おお >[Re:9] egeriaさんは書きました : > Trizolはguanidine thiocyanateではありませんでしたか？　wakoでグアニジンチオシアン酸塩を調べると「アセトンに可溶」と書かれているので、こちらはうまくいくのかもしれません。ただ、guanidine HClだとほとんど溶けないと思います。 guanidine thiocyanateです。グアニジン塩という事で同一視してました。おそらくイオン化してないguanidine thiocyanateの状態で溶けるという事かなと思いました。

(無題) 削除/引用 No.11582-9 - 2023/07/04 (火) 12:47:04 - egeria > 実際にTrizolなどからアセトン沈殿をやっていてプラクティカルにはワークしていました。 Trizolはguanidine thiocyanateではありませんでしたか？　wakoでグアニジンチオシアン酸塩を調べると「アセトンに可溶」と書かれているので、こちらはうまくいくのかもしれません。ただ、guanidine HClだとほとんど溶けないと思います。

(無題) 削除/引用 No.11582-8 - 2023/07/04 (火) 08:31:21 - おお >[Re:5] egeriaさんは書きました : > グアニジン塩酸は有機溶媒にほとんど溶けないのでアセトン沈殿は難しく、TCA沈殿も困難です。 > 実際にTrizolなどからアセトン沈殿をやっていてプラクティカルにはワークしていました。沈殿後９５％エタノールで洗うのでその時に除けているかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11582-7 - 2023/07/04 (火) 08:28:47 - Gdnマン みなさまいろいろな情報をありがとうございました。 グアニジンで不溶性画分を可溶化させたのち、グアニジン入りのままアフィニティ精製をかけていますので、そのどこかのタイミングで、グアニジン入りのままタンパク質精製ができていることを吸光度以外の方法(SDSPAGE)で確かめたかったのです。 とても勉強になりました。EtOH沈殿の方法は気軽にできてよさそうですね。 早速試してみたいと思います。 それではまたよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.11582-6 - 2023/07/04 (火) 07:50:03 - momo StrataClean resinにタンパク質を吸着させてグアニジンを除くという方法をどこかで読んだはずなのですが思い出せません。Googleで"strataclean guanidine"と検索すると断片的な記載がいくつか見つかりはしますが。

(無題) 削除/引用 No.11582-5 - 2023/07/04 (火) 05:53:27 - egeria グアニジン塩酸は有機溶媒にほとんど溶けないのでアセトン沈殿は難しく、TCA沈殿も困難です。 ただしエタノールには溶けるので、エタノールでタンパク質を沈殿させつつグアニジンを除去する方法があります。 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/1888015/ 下のページに実際のプロトコルが載っています。 http://wolfson.huji.ac.il/purification/Protocols/ProteinPrecipitation.html 難点としては、サンプルの10倍以上のエタノールを加えることになるので（論文では1:40を推奨していますが1:10や1:20でも大体ワークします）、多量のサンプルを処理することはできません。SDS-PAGEに特化したやり方と思えばよいと思います。

(無題) 削除/引用 No.11582-4 - 2023/07/04 (火) 02:14:44 - おお グアニジン存在下でSDSの沈殿を避けるには尿素をつかえばいいです。 あかねさんのような方法論をとるなら３uｌのサンプルに１５uｌの６M尿素入りサンプルバッファーを加えて、加熱しないで室温放置数分後泳動すればいいでしょう。グアニジンは反対方向に流れるのでWellの上部でいくらか沈殿するかもしれません。 しかし私の経験上そんなにきれいに流れないんですよね、、、薄めても。 確かSDSの代わりにサルコシル（かな）を使うといいというのがパテントかなんかで書いてあったように思うのですが、ちょっと記憶に定かじゃありません。 マイクロチューブ型のスピンカラムを使う手もあるにはありますね。G-25とかが詰められて売っているやつ（自作でもできますが）。ただサンプルを乗せる前にバッファー置換がひつようですね。４M以上の尿素で置換しておけばほとんどのタンパクが不溶化せずに、ゲルにも吸着せず回収できると思います。収量的にはどうなのか（回収率が毎回一定しているか）はそんなに経験がないのでわかりません。 もう一つの方法としてはアセトンなどでたんぱくを沈殿させて、リカバーする方法ですが、場合によっては沈殿が溶けにくくなっていたりします。 微量用簡易透析ツールなどもありますし、自作も可能でしょう。微量なので半日もすれば泳動には差し支えないとおもってます。

(無題) 削除/引用 No.11582-3 - 2023/07/03 (月) 19:48:16 - えdrf 単に電気泳動して発現を確認するのが目的ならば、グアニジンでの可溶化にこだわらなくても、発現させた大腸菌の一部を集めてSDS-sample bufferに溶かせばよいうようにおもいますが。いやどうしてもグアニジンで可溶化した画分でというならば、たとえばグアニジンのかわりに変性機序が似ている8M Ureaを使うとか（高濃度ureaはSDSとも合いますし電気泳動を妨害することもないです。ただ還元時に加熱はせず、かわりに室温ないし３７度で１〜２時間以上放置してください）もできるとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.11582-2 - 2023/07/03 (月) 19:13:36 - あかね 8連PCRチューブにグアニジンに溶かしたサンプルを3 ul入れて、1xSDS-PAGE bufferを15ul程度いれます。 ヒートブロックで95°C 5minすると、析出していたグアニジンが溶解します。高温だと、SDS入りbufferでもグアニジンは溶けます。一方、温度が下がるとまた析出します。 ですので、サンプルをゲルにアプライする直前まで温めておいて、すぐにアプライ&泳動スタートします。 当方では、PCRチューブをヒートブロックにおいたまま、取り外し可能なヒートブロックをチューブごと、泳動そうの前までもっていき、アプライしています。もたもたすると、wellの中で析出しますが、とっとと泳動スタートしてください。

不溶性画分のグアニジン処理 削除/引用 No.11582-1 - 2023/07/03 (月) 18:20:05 - Gdnマン いつも楽しく拝見させていただいております。 今大腸菌BL21で、あるタンパク質を発現させております。 超音波破砕したのち、inclusion bodyに目的のタンパク質がいくことを確認しまして、グアニジンで溶解させ、透析法にてリフォールディングして目的のタンパク質を獲得しています。 そこで皆さんに少しお伺いしたいのですが、 グアニジン溶液の段階で発現の確認をしようと (SDS-PAGEを行おうと)サンプルバッファー等に溶解させますと、グアニジンが析出しますよね？ 一般的には透析後して初めて、タンパク質溶液サンプルとしてSDS-PAGEを行うことができるようになると考えているのですが、何か簡便かつ短時間の処理で、グアニジン入りタンパク質溶液を直接SDS-PAGE用サンプルにする方法を持っている方はいらっしゃらないでしょうか？ 横着せずに透析しなよといわれればその通りなのですが、何か良い方法をもしお持ちの方がいればご教示ください。

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