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(無題) 削除/引用 No.11580-8 - 2023/07/05 (水) 22:02:45 - ある SYBR masterさま、ご返信ありがとうございます。 AFLPは自分も存じております。(学生時代のメンバーが扱っていました) 確かに片側1塩基の違いでも区別できますね。 そう考えれば、他の条件を整えてやれば、片側の末端一塩基の違いでも問題ないと理解できました。 論文化は考えていませんが、ちょっといろいろ調べてみても面白そうです。 ありがとうございます！

(無題) 削除/引用 No.11580-7 - 2023/07/05 (水) 19:54:39 - SYBR master >[Re:6] あるさんは書きました : > 前後の配列やプロダクトの長さなど、諸々の条件もありそうですが、例えば片側プライマーが同じで、もう片側の 3末の一塩基だけ異なる場合は増幅効率はどの程度落ちそうでしょうか。 AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)と言う技法がありまして、この時にprimerの3末2塩基だけが違うprimerで、256 set[(4*4)*(4*4)]のPCRを行ったことがありますが、基本設定(同一配列部分のTm)さえできていれば、片側1塩基の違いでもキチンとDNA配列の区別できることが解っていますので、primer設計とサイクルのアニーリング温度の設定の問題だけだと思います。PCRが走る程度まで、primer濃度を下げた記憶はありますが、どのくらいだったかまでは、もうすでに記録が手元に無いので覚えていません。 > 当方は論文化などは考えておらず、興味本位で質問させていただいています。 いや、できるなら、しちゃってくださいｗ AFLPが沢山使われていたのはもう20年くらい前で、たぶん知っている研究者は知っているけど、知らない研究者は全く知らないので、逆にselective-PCRやAFLPは新鮮かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11580-6 - 2023/07/05 (水) 12:34:00 - ある おおさま、SYBR masterさま ご連絡ありがとうございます。 3末端のニ塩基の違いはやはり大きいのですね。 前後の配列やプロダクトの長さなど、諸々の条件もありそうですが、例えば片側プライマーが同じで、もう片側の 3末の一塩基だけ異なる場合は増幅効率はどの程度落ちそうでしょうか。 当方は論文化などは考えておらず、興味本位で質問させていただいています。 どうぞ宜しくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.11580-5 - 2023/07/04 (火) 22:25:10 - SYBR master >[Re:3] あるさんは書きました : > ですので、最終的なSNP判定は間違えないかと思うのですが、例えば環境DNAの検出などでリアルタイムPCRを使用する eDNAで検出対象を何にしているか存じ上げませんが、例えばMetaGenomeで16s rRNA(ゲノムなのでrDNAか?)を対象とするなら、primerの末端2塩基に違いを持たせられるなら、PCRで使用するprimer濃度を段階的に下げていくと、非特異的な検出を防げ、対象生物のみの検出が行えます。 個人的な経験ですが、この方法で16種類程度の原核微生物の存在を、PCRのみで区別したことがあります。ただ、実行した院生がこの重要性に良く理解できなかったみたいで、またどれくらい需要があるか私には良く解らないので、論文化はしていませんけど、必要でしょうか？。需要がそこそこ有るようなら、予算の関係もありますが、ちょっと論文にできるかどうか考えてみます またこの場合、内部配列も多少変わるので、TaqMan-probeの特異性も上げられると思います。

(無題) 削除/引用 No.11580-4 - 2023/07/04 (火) 08:28:41 - おお 3'末端、あるいは末端あるいはその隣の塩基がミスマッチであれば増幅効率は著しく落ちるますが、それより内側だと配列によってばらつきが出ますが結構増幅されてしまうというデーターを見たことがあります。たぶんここのある質問でそれを示した論文を紹介したようなきがします。

(無題) 削除/引用 No.11580-3 - 2023/07/03 (月) 17:42:25 - ある 8さま 例えばですが、SNPのタイピングだとある程度のミスタイピング(プローブのアニールミス)があったとしても、二つのアリルの選択だと大多数は正しい方のプローブはアニールすると思います。 ですので、最終的なSNP判定は間違えないかと思うのですが、例えば環境DNAの検出などでリアルタイムPCRを使用する場合は、一種類のプローブ/プライマーセットを使うので、よく似た種類の生物を擬陽性として検出してしまうことはあり得ないのかと思った次第です。 自分たちのラボでプライマーとプローブを設計する場合、どこまでの配列の相同性があれば擬陽性を抑えられるのかお分かりになる方いらっしゃるでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11580-2 - 2023/07/03 (月) 16:16:22 - 8 TaqManでSNPを検知する方法もあるので。実際に使ったことがあるわけではないのでqPCR用のものとtaqの活性の違いがあるのかは知りませんが。

リアルタイムPCRの特異性の保証について 削除/引用 No.11580-1 - 2023/07/03 (月) 12:18:39 - ある こちら利用させていただきます。 お分かりの方いれば教えて下さい。 リアルタイムPCRでプローブ方を採用する場合、インカレーター方よりは特異性は高いかと思いますが、対象領域の特異性はどこまで保証できるのでしょうか？ 仮に、対象領域に類似した配列があって、プライマーアニールサイトの変異がプライマー配列のちょうど真ん中くらいに一つだけある場合は(プローブ配列は同じ)、普通に増幅がかかるような気がします。どれくらいの変異が有れば特異的な検出と言えるでしょうか？ どうぞ宜しくお願いします。

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