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(無題) 削除/引用 No.11576-15 - 2023/07/04 (火) 20:17:01 - k む様、おお様 たくさんのご助言いただきありがとうございます。 自分の研究目的の見直し、指導教員と相談してみようと思います。 私のつたない質問にここまでありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11576-14 - 2023/07/04 (火) 09:36:48 - おお >[Re:10] kさんは書きました : > みなさま、ありがとうございます。 > > 方針に関しては指導教員と話してみたいと思います。 > > qPCRについて、同じプライマー、同じサンプル、同じ手技（のつもり）で異なる結果が出るのはなぜでしょうか。 > 1回目に成功したと思って、2回目をやると異なる結果になります。 > 解決するためには、何度もやって練習するしかないのでしょうか。 何度やっても問題点が分かってなかったらやるたびに違う結果になる可能性があるから、そういうのを探りつつやっていくしかない。チェックポイントもいろいろあると思うしあなたのラボで経験がある人に相談してください。 よくわからないけど、そうした場合PCRしてバンドをゲルで検出しても同じことが起こって結論が出ないかもしれない。RNAが途中で壊れてませんか？

(無題) 削除/引用 No.11576-13 - 2023/07/04 (火) 07:27:06 - む >[Re:10] kさんは書きました : > qPCRについて、同じプライマー、同じサンプル、同じ手技（のつもり）で異なる結果が出るのはなぜでしょうか。 あなたが一番気になっているのはこれですね？ > 1回目に成功したと思って、2回目をやると異なる結果になります。 > 解決するためには、何度もやって練習するしかないのでしょうか。 あなたのおっしゃる「異なる結果」がどう異なっているか、どの程度異なっているか、どういうプロトコールで実験をしたのかわからないのでここで答えられる人はいないと思います。ただ、何度か同じ実験をしてそれらの結果が全く同じになることはまずありません。 > 方針に関しては指導教員と話してみたいと思います。 何をもって成功とするか、あなたの実験結果をもとに指導教員と話してみてください。検量線がきちんと引けていたり、（入れているかはわかりませんが）ポジティブコントロールやネガティブコントロールがきちんと出ていれば手技に問題ないと思いますが、そのあたりの判断も指導教員と話してみてください。 もう一つだけ気になったのが、あなたの研究目的は「最終的な目的としては対象分子のタンパク質での発現量の定量を行いたい」ですよね？「PCRの結果が毎回異なる原因について」ではないですよね。結果が妥当であれば次の実験をしてもいいと思いますよ。指導教員とよく話してみてください。

(無題) 削除/引用 No.11576-12 - 2023/07/04 (火) 02:19:27 - おお 一層の事ノーザンブロットでもいいかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.11576-11 - 2023/07/03 (月) 20:44:13 - 774 バンド定量って、逆転写してリアルタイムPCRして、そのPCR産物をアガロースで流してバンドの濃淡を定量化ってことですか? 逆転写だけしてそのPCR産物(total RNAに対応するtotal cDNA)を泳動してバンドの濃淡を見る? 抗体云々と言うなら最終的にはタンパク質としての変動を見たいのでしょうが。 mRNA発現量が上がるタイミングとタンパク質の発現量が上がるタイミングは違いますし、必ずしもmRNAは見ません。 タンパク質の発現量そのものより転写活性化が起きていることが重要な事象であればmRNAとして検討する必要があるでしょう。 「同じサンプル」と言うのは「同じ条件・同じ手法で調製したサンプル」でなく本当に同じサンプルですか? それが回によって異なると内部標準の反応も信用できないし定量PCRにならないでしょう。 検量線がいつも同じように引けているなら定量PCRの手技には問題ないはずで、サンプルの調製に何か問題があるのかもしれないけど。

(無題) 削除/引用 No.11576-10 - 2023/07/03 (月) 20:15:01 - k みなさま、ありがとうございます。 方針に関しては指導教員と話してみたいと思います。 qPCRについて、同じプライマー、同じサンプル、同じ手技（のつもり）で異なる結果が出るのはなぜでしょうか。 1回目に成功したと思って、2回目をやると異なる結果になります。 解決するためには、何度もやって練習するしかないのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11576-9 - 2023/07/02 (日) 18:05:39 - おお https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6060631/ https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1385299X99000458 読んでみたら？

(無題) 削除/引用 No.11576-8 - 2023/07/02 (日) 17:51:58 - おお >[Re:6] kさんは書きました : > みなさま、様々な方法をご教授いただきありがとうございます。 > > 質問があやふやで申し訳ありません。 > 研究費の都合などから所属ラボでは、遺伝子発現で差があることを確認してから、対象の抗体の購入を検討するという方針となっています。 まあ方針になっているなら、このトピを読んで納得する研究の進め方かは分からないですけど、そうですかと言うぐらいです。 > ただ、バンド定量でも内部標準と対象遺伝子の増幅効率の差は結果に反映され、やはり定量PCRでの検討が必要なのではと考え、他の方であればどうするのかが気になり質問させていただきました。 例えばターゲットの効率が1サイクルで1.732倍でコントロールが1000コピー、テストが2000コピーだったとします。4サイクル回すと9倍になりますので、それぞれ9000と18000コピーです。 内部標準は効率が2倍コピー数はそれぞれ10000と5000。4サイクル回すと160000と80000です。 PCRしないコピー数で内部標準当たりの量で計算する、ターゲットはコントロール1に対して4です。この比は4サイクルまわしたあとで計算しても一緒です。すでに増えたコピー数を計算してるので確認してください。 しかしリアルタイムのqPCRがなぜうまくいかないんですかね。プライマーのデザインし直すのが普通やることと思うのだけど、、、手技的な問題？

(無題) 削除/引用 No.11576-7 - 2023/07/02 (日) 14:00:07 - む >[Re:6] kさんは書きました : > 研究費の都合などから所属ラボでは、遺伝子発現で差があることを確認してから、対象の抗体の購入を検討するという方針となっています。 > 現在は定量PCRでの定量を試みており指導教員に上手くいかないことを相談したら、 上手くいかない、というのはPCR実験自体がうまくいかなかったのですか？それとも実験はできたけど遺伝子発現で差がでなかったということですか？ > 「逆転写PCRでのバンド定量で差が見られればそれでいいと思う」と言われました。 それでいい、とは何がいいのですか？実験手技が容認できるのいい、あなたがやったPCRのの結果をみてあなたはうまくいってないと思ったけど指導教員からみたら差がみられるからこれでいいよのいい、「逆転写PCRでのバンド定量で差が見られればそれで（抗体を買って）いいと思う」のいいですか？ > ただ、バンド定量でも内部標準と対象遺伝子の増幅効率の差は結果に反映され、 結果にどう反映されたのですか？ > やはり定量PCRでの検討が必要なのではと考え、他の方であればどうするのかが気になり質問させていただきました。 現在は定量PCRでの定量を試みているんですよね？ あなたの考えている「定量PCR」と「逆転写PCRでのバンド定量」と「バンド定量」はどう違うのですか？同じモノですか？ > 最終的な目的としては対象分子のタンパク質での発現量の定量を行いたいです。 だったら最初から対象分子のタンパク質の発現量を定量する実験をすればいいようにも思いますが。 > 初歩的な質問ですが、ご教授いただけますと幸いです。 初歩的な質問というよりも何を聞きたいのかがよくわからないです。

(無題) 削除/引用 No.11576-6 - 2023/07/02 (日) 13:09:45 - k みなさま、様々な方法をご教授いただきありがとうございます。 質問があやふやで申し訳ありません。 研究費の都合などから所属ラボでは、遺伝子発現で差があることを確認してから、対象の抗体の購入を検討するという方針となっています。 現在は定量PCRでの定量を試みており指導教員に上手くいかないことを相談したら、「逆転写PCRでのバンド定量で差が見られればそれでいいと思う」と言われました。 ただ、バンド定量でも内部標準と対象遺伝子の増幅効率の差は結果に反映され、やはり定量PCRでの検討が必要なのではと考え、他の方であればどうするのかが気になり質問させていただきました。 最終的な目的としては対象分子のタンパク質での発現量の定量を行いたいです。 初歩的な質問ですが、ご教授いただけますと幸いです。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.11576-5 - 2023/07/02 (日) 12:07:54 - あの 現在は、次世代シーケンサーを用いた　RNAseq法などで、発現しているmRNAを 網羅的に調べられる時代です。 それから次のようなサイトで、様々なヒト臓器や、セルラインで発現しているmRNAを 検索できる時代です。さらに、そこからよさげな抗体商品の候補も調べられます。 https://www.proteinatlas.org/ これらを理解してみて、上記サイトや既発表論文等も調べてみて、研究戦略を考えることを オススメします。

(無題) 削除/引用 No.11576-4 - 2023/07/02 (日) 05:58:55 - おお 質問を読み返すと色々とチグハグなのでもう一度どう言う実験をやりたいか整理して、細かい事を開示できなければ、研究をシェアしている上の人などにそうだんしてください。 抗体を購入するかの判断材料とかんがえているならRNAseqのデーターとか持っているって事ですかねえ、、、それならPCRでバリデーションするのが王道ですけど、抗体を買うかどうかは研究方針や興味の対象による。 あとは研究スタイルによって色々やり方にバリエーションがあっていいので研究グループ内で決めるべきかと思います。

(無題) 削除/引用 No.11576-3 - 2023/07/02 (日) 05:47:30 - おお 研究の興味が、そのタンパク質の影響で起こる事象で有れば、そのタンパクを抗体で見ればいいわけで、mRNAレベルの解析はその限りにおいては必要ありません。 タンパクの発現に関しては、その過程が2の次(メカニズム的に分かっっているとか、タンパクとそれによる事象を見ればいいとか)の場合必要性は基本的にはないです。 転写を含む発現の様式の確認がひつようならmRNA検出をとわれるとおもいます。 PCRで定量するなら、高感度色素を使って(ピコオーダーで検出できるようなもの)、増幅効率が飽和しないサイクル数でsemiquantification としてデーターを載せている論文はありますね。実際は、飽和してない領域では相対定量ができているはずですが、そう言う認識は広がってないようです。まあ、発現量に差があれば片方が飽和していると言う事は容易に起こるでしょうから、ダイナミックレンジのの問題はあると思いますが。 昔は極力感度を上げ(RIをつかう)、ダイナミックレンジを稼いで、定量すると言ったこともやられていました。

(無題) 削除/引用 No.11576-2 - 2023/07/01 (土) 20:08:35 - む どういうことですか？ 抗体を購入して、どのような実験を想定されていますか？ もう少しくわしく教えてくれませんか？

逆転写PCRによる定量について 削除/引用 No.11576-1 - 2023/07/01 (土) 18:14:57 - k いつもお世話になっております。 遺伝子の定量についてです。 論文に載せるかは別として、逆転写PCR（RT-PCR）によるバンド定量は、抗体を購入などの実験を進める要因になるでしょうか。 cDNA濃度やサイクル数を下げて、バンドの濃淡が出るようにして相対的な発現量の差を検出するといった方法です。 何卒よろしくお願いいたします。

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