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(無題) 削除/引用 No.11566-19 - 2023/07/01 (土) 21:10:27 - G25 No.11566-4 で発した問 >サンプルバッファー(SB)とは何者？　どういう用途、そういう成分？ に対して、回答がないのだけれど、はっきりさせたほうがいいんじゃないか。 Laemmli サンプルバッファーだとしたら4% SDSというのはスタンダードより2倍濃いし、

(無題) 削除/引用 No.11566-18 - 2023/07/01 (土) 12:34:12 - MIDI 抽出の目的が精製なのか解析なのかわからないが バッファーで粘度が高くなってピペッティングできない とかは既に話されてるけど ペレット自体が懸濁できないって話なら 培養細胞なら500gでも落ちるから ペレットが固いってのはそんなにないとは思う 菌体っていうのが大腸菌とかであって SBが溶菌か泳動前処理の変性なら エッペン底に2,3mmの量があって チップでつついてもはがしにくいってのはわからんことはない そもそも1mL培養して数本をまとめるって 1本あたりの菌体量＝タンパク量が取れないからするのであって ペレットがバッファーと混ざらないほど多いのであれば まとめる必要もないのでは ペレットとるだけなら上清の透明具合見て時間決めればいい 適当なプロトコールで miniprepでも10000gで1，2分 MIDIなら3000g10分程度だから 遠心時間刻むだけでも解決しそうだけど 数本まとめたトータルが5mL以上になるなら15mL遠沈管で回転数落とすとか 丸底のエッペン（2mLとか）やラウンドチューブなら 先がとがってない分ペレットははがれやすいし 培地を除いた状態でVORTEXすれば バッファーを入れてから懸濁するよりは 菌体はほどけやすくなると思うけど。 MIDIで50mLチューブで集めたペレットは 逆さにしておくだけで垂れてくるくらいだし。

(無題) 削除/引用 No.11566-17 - 2023/06/29 (木) 10:44:41 - YK 私は1ml培養のとき、4℃、4000rpm、5minでやってたのでその条件だとやりすぎかな？と思います。 それとほかの方がおっしゃるようにSDSなどの界面活性剤を入れると大腸菌が溶解してしまい、ゼリーに包まれたようになるのでそこからの懸濁は困難かと思います。 最終的に1本のチューブにまとめるのであれば、二度手間かと思いますが、ＳＢではなくＰＢＳなどに懸濁して、回収後に再度遠心してみてはどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11566-16 - 2023/06/29 (木) 07:49:54 - Skeptics 大腸菌からプラスミドを調製されたことはありますよね？その際には似たような条件で沈殿させた菌体ペレットは均一に懸濁できているのではないですか？ 何人かの方が指摘されていますが、塊になっている菌体ペレットにSDSを含む溶液を加えたせいで、塊の外側だけが溶菌して高分子DNAが露出し、ゼリー状に菌体ペレットを包み込んでしまってそれ以上の懸濁を邪魔してしまっているのだと思います。 解決策はG25さんがお示しになっているとおりです。

(無題) 削除/引用 No.11566-15 - 2023/06/29 (木) 01:16:17 - おお ＞10000rpm、10min おそらくマイクロチューブ用の遠心機で、それぐらいだと一万ｇ前後かなと思います。 細胞が固まらないようにというなら、遠心はスピンダウン程度（遠心をスタートして回転数がマックスぐらいになったら止める）ぐらいでも大腸菌なら回収できると思います。どれくらい緩くなるかはわかりませんけど。

(無題) 削除/引用 No.11566-14 - 2023/06/29 (木) 01:11:06 - おお >[Re:9] LST100さんは書きました : > >[Re:7] おおさんは書きました : > > >[Re:3] LST100さんは書きました : > > > >のなめ 様 > > > > 勉強不足で申し訳ないのですが、沈殿のペレットが固すぎて取れないと言うものではないのでしょうか？ 固すぎて取れないと言えるかもしれませんが、細胞が融合して強固な一塊になったわけでもありませんのでほぐしようがあるという事です。またSDSは細胞を溶かしますから、細胞が固まって固くなったとしても溶け出てきます。それを促進するのにHeatingするという選択肢もどなたか提示していますよね。

(無題) 削除/引用 No.11566-13 - 2023/06/28 (水) 23:24:56 - たこ助 ペレットが解れないということはあまり記憶にないですが。。。 当方はズボラなので、PBSなどに懸濁することなく、1xLaemmli bufferを入れてソニケーション(パルスで数発)、ボイル、遠心の後に泳動サンプルとして使用しています。 ペレットに対してバッファーが少なすぎるということがあったりしないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11566-12 - 2023/06/28 (水) 20:54:40 - G25 Tapping (デコピンの要領で)する。 チューブ一本ずつを左右の手で斜めに構えて、底を接触させた状態でvortexすると底が衝突する衝撃で解れる(Molecular Cloningにも載っている由緒正しき作法)。

(無題) 削除/引用 No.11566-10 - 2023/06/28 (水) 19:27:04 - ema 10000rpm　とありますがGはどれくらいになるのでしょうか。つぶれるほど遠心をかけてませんか。 また、遠心後、上清をすててすぐにBufferを入れるのではなく、タッピングをしてばらばらにチューブの中でしてからSBを入れていますか？ どうしてもならソニケーターをかけることもあるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.11566-9 - 2023/06/28 (水) 17:45:18 - LST100 >[Re:7] おおさんは書きました : > >[Re:3] LST100さんは書きました : > > >のなめ 様 > > > > 界面活性剤としては、20％SDSが入っています。 > > すごい濃いですね、、、SDSＰＡＧＥなら終濃度1-2%だとおもうけど、、、 > そういう前提でやるなら、菌体のペレットは少量のPBSとか、菌体によっては単に水とかを入れて懸濁状態にしてからそのサンプルバッファーを(2x)で先に加えたPBSと同量加えれば良い。 > > その他出来そうな事は菌体を遠心してペレットにする時ガラスビーズを一緒に入れておけばそのバッファーを入れた後でも分散は楽になる。入れる前にボルテックスなどでグラスビーズを躍らせると、ペレットが緩んでより良いと思う。 終濃度は、4％でした。すいません。 勉強不足で申し訳ないのですが、沈殿のペレットが固すぎて取れないと言うものではないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11566-8 - 2023/06/28 (水) 17:41:16 - LST100 >[Re:5] G25さんは書きました : > 終濃度20%のSDSじゃないよねえ。ほとんど飽和溶液だ。 > > 再懸濁しにくいのは沈殿にいきなりSDSをぶっかけているので、おそらく表層だけ中途半端に溶菌して中のほうが溶けずにダマになってるんでしょう。 > 先程書いたようにボイルをすれば全部溶けそうだ。 > > もっとエレガントなのは、いきなりSDS入りの「サンプルバッファー」で懸濁しようとせずに、非変性的なバッファーで細菌を再懸濁して、そこに10xとか2xとの濃縮サンプルバッファーを1xになるように加えるというような方法。 > > 終濃度は、4％でした。すいません。 勉強不足で申し訳ないのですが、沈殿のペレットが固すぎて取れないと言うものではないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11566-7 - 2023/06/28 (水) 17:27:55 - おお >[Re:3] LST100さんは書きました : > >のなめ 様 > > 界面活性剤としては、20％SDSが入っています。 すごい濃いですね、、、SDSＰＡＧＥなら終濃度1-2%だとおもうけど、、、 そういう前提でやるなら、菌体のペレットは少量のPBSとか、菌体によっては単に水とかを入れて懸濁状態にしてからそのサンプルバッファーを(2x)で先に加えたPBSと同量加えれば良い。 その他出来そうな事は菌体を遠心してペレットにする時ガラスビーズを一緒に入れておけばそのバッファーを入れた後でも分散は楽になる。入れる前にボルテックスなどでグラスビーズを躍らせると、ペレットが緩んでより良いと思う。

(無題) 削除/引用 No.11566-6 - 2023/06/28 (水) 17:16:25 - G25 >上清を捨てた後にサンプルバッファー(SB)を入れ懸濁し、1本のチューブに数本分の懸濁液を回収しようとしています。 溶菌してしまうとゲノムDNAの流出で非常に粘稠になりハンドリングが難しくなります。 やるんだったら、非変性のバッファー（あるいは水でもいいでしょう）で再懸濁した懸濁液を一本のチューブにプールして、そこに濃縮SBを1xになるように入れるというのがいいと思う。

(無題) 削除/引用 No.11566-5 - 2023/06/28 (水) 17:12:02 - G25 終濃度20%のSDSじゃないよねえ。ほとんど飽和溶液だ。 再懸濁しにくいのは沈殿にいきなりSDSをぶっかけているので、おそらく表層だけ中途半端に溶菌して中のほうが溶けずにダマになってるんでしょう。 先程書いたようにボイルをすれば全部溶けそうだ。 もっとエレガントなのは、いきなりSDS入りの「サンプルバッファー」で懸濁しようとせずに、非変性的なバッファーで細菌を再懸濁して、そこに10xとか2xとの濃縮サンプルバッファーを1xになるように加えるというような方法。

(無題) 削除/引用 No.11566-4 - 2023/06/28 (水) 16:39:44 - G25 サンプルバッファー(SB)とは何者？　どういう用途、そういう成分？ 日常的にサンプルバッファーというと、SDS-PAGEのサンプルバッファーを想起しますけど、 もしそうであれば、SDS-PAGEサンプルの前処理でやるようにボイルすればほとんど溶けると思います。 単に沈殿した細菌を再懸濁しようと言うだけなら、それほど困難ではないはずだけど。

(無題) 削除/引用 No.11566-3 - 2023/06/28 (水) 14:17:02 - LST100 >のなめ 様 界面活性剤としては、20％SDSが入っています。

(無題) 削除/引用 No.11566-2 - 2023/06/28 (水) 14:01:45 - のなめ sample bufferには界面活性剤等が含まれていたりしますか？

ペレット 削除/引用 No.11566-1 - 2023/06/28 (水) 13:52:11 - LST100 こんにちは。 タンパク質抽出の過程で得られるペレットが固すぎるため、様々な意見を聞きたいです。 まず、菌体のみを回収するために、1.5mlチューブに対して本培養液を1ml程度入れてます(数本)。その後、24℃、10000rpm、10minで遠心分離し、上清を捨てた後にサンプルバッファー(SB)を入れ懸濁し、1本のチューブに数本分の懸濁液を回収しようとしています。 しかし、この際のペレットが固すぎるため、SBを入れ懸濁しようとしても懸濁にならないです。 ボルテックスやピペッティングなどを試してみたのですが、全く懸濁にならなかったです。最終的にチップの先端で削る取るように取ったのですが、菌体はある程度剝がれたもののSBと混ざり合わずピペットマンで吸い上げ回収するのが困難でした。 そこで、現在考えているのは、回転数と時間を8000rpm、5minなどで行おうと考えているのですが、ほかに良い意見や回収しやすい方法などあれば是非ご教授していただきたいです。 よろしくお願いいたします。

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