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(無題) 削除/引用 No.11563-6 - 2023/07/01 (土) 22:15:31 - SYBR master >[Re:4] G25さんは書きました : > 1) M13ファージあるいはf1 oriをもつファージミドにクローニングしてssDNAファージから環状 ssDNAとして取得する。 この方法はいまは使われていません。面倒なのと、off-targetを防ぐために目的外DNA配列をssDNA化することは無いです。 > 2) asymmetric PCR (片側プライマーのみで走らせるPCR)でdsDNA鋳型からssDNAを増やす。 CRISPRで必要なssDNA量は想定しているより必要なので、鋳型×サイクル数でしか得られないssDNA量では足りないです（意外に長さも結構長いし）。現状最も使われているのは、Lambda Exo系のssDNA作成方法です。

(無題) 削除/引用 No.11563-5 - 2023/07/01 (土) 22:06:04 - SYBR master 細かい部分(レシピ)は残念ですが解らないですが、使用している酵素は推測可能です。 Takaraさんのキットであれば、標的はPCR産物で先にAAさんの書いた >[Re:2] AAさんは書きました : > 片側を末端リン酸化修飾プライマーにしてドナー配列をPCR、ラムダエキソヌクレアーゼでリン酸鎖を消化、 の最後にexonuclease III(exoIII)を加えていると思われます。lambda Exoは5末にリン酸基をを持つstrandを特異的に分解(5'-3'exo活性)しますが、添付されて使用しているbufferでは、どうも最後まで分解できない事が多々あるようです(これはDNA origami関連の論文からの情報です）。そこで、その消化し切れていないdsDNA部分を、途中からExoIIIで分解除去しているようです。ExoIIIは３'-5'exo活性がありますが、dsDNA特異的なのでlambda Exoで作成されたssDNA部分(3'突出末端状態）に反応しませんが、残存しているdsDNAの末端はbluntになるので、分解を始め欲しいstrandだけssDNAになります。 ここら辺の技術は、30年くらい前のRIを使ったシークエンスで、plasmidにクローニングした目的配列の、deletion cloneを作るための技術が応用されています(たぶんG25さんが詳しいw)。

(無題) 削除/引用 No.11563-4 - 2023/06/28 (水) 10:05:34 - G25 ノックイン用のテンプレートとしての利用法があるかどうかはわからないけど、 1) M13ファージあるいはf1 oriをもつファージミドにクローニングしてssDNAファージから環状 ssDNAとして取得する。 2) asymmetric PCR (片側プライマーのみで走らせるPCR)でdsDNA鋳型からssDNAを増やす。 ssDNAプローブを得るなどの目的でよくやりました。

(無題) 削除/引用 No.11563-3 - 2023/06/28 (水) 01:26:09 - おお https://academic.oup.com/nar/article/50/3/1256/6519359 この論文では非酵素的な方法がのってますね。 片方のストランドをビオチン化して変性してストレプトアビジンビーズで分けるってことだと思いますが。 最近のPCR酵素は非常によく走るので、ほしいほうのストランドのプライマーだけ加えてPCR反応の温度操作でｓｓDNAを作ることができないかしら。。。昔からそういうｓｓDNAの作成プロトコールがあるにはあったはず。

(無題) 削除/引用 No.11563-2 - 2023/06/27 (火) 22:16:57 - AA １ Nickaseの認識配列を末端に入れておいて一本鎖が切り出されるようにする。 切り出したものを尿素ゲルなど変性ゲルで泳動して切り出し、精製。 ２ 片側を末端リン酸化修飾プライマーにしてドナー配列をPCR、ラムダエキソヌクレアーゼでリン酸鎖を消化、消化産物を泳動して(以下略

ssDNAの自作は可能でしょうか？ 削除/引用 No.11563-1 - 2023/06/27 (火) 19:24:52 - ssDNA いつも拝見させていただいております。 CRISPR-Cas9を使ったノックインをしていこうと思っています。 標的配列上流と下流それぞれ500 bpをクローニングし、その間にノックインしたいタグ配列を持たせます。 そのノックインドナーを持つプラスミドからssDNAを調製したいです。 キットを買うとそれができそうです。 ただ、キットを使わず、ssDNAを自作されておられる方、いらっしゃいますでしょうか？ もしいらっしゃいましたら、レシピをご教示いただけましたら幸いに存じます。 不躾なお願いで大変恐縮しております。 どうぞよろしくお願いいたします。

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