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(無題) 削除/引用 No.11559-6 - 2023/06/29 (木) 00:21:02 - ドガ 出発材料の純度（夾雑物のあり/なし）の違いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.11559-5 - 2023/06/28 (水) 21:49:52 - SYBR master >[Re:1] みずきさんは書きました : > 現在、Nucleospin tissue kit（Machery Nagel社）を用いてスピンカラムで > どちらもエタ沈を利用していることに変わりはないので気にしておりません 基本的に、核酸の精製方法に関する理解が間違っています。スピンカラム(ガラス系=シリカメンブレン）で、核酸が精製できるのは、エタチンとは違う理屈です。参考となるサイト示します。 https://blog.takara-bio.co.jp/nucleic_acid/Silica_column で、ゲノムやRNAの時にEtOHを加えるのは、目的外の核酸をのメンブレンへの吸着を阻害するためであって、例え途中でエタノールを加えたとしても、エタチンでは無いです。 https://asset.fujifilm.com/www/jp/files/2019-10/5c2b595e8647a30a616e20c4f0a1af24/rd_report_ff_rd051_009.pdf ここからは予想なのですが、多分ビオチンの標識(ラベルの方法がよく解らないけど、特定の塩基に標識するのであれば）によって、物理的に立体障害を起こすため、genome DNAが上手くカラムに吸着しないため、収量の低下が引き起こされているのでは無いでしょうか。 基本的にエタチンは、そこに存在する核酸を全部沈殿させる方法です。条件さえ整えれば、ssDNAでもmiRNAやsiRNAでも沈殿できます。

(無題) 削除/引用 No.11559-4 - 2023/06/28 (水) 13:52:24 - みずき G25さま ＞DNAの取り方の違いはラベルをするタイミングによるのではなく、それぞれの実験で要求されるintactnessの違いなんじゃないかなとも思います。 ご意見を頂き誠にありがとうございます。 ただ、その論文では異なる手法でDNAを抽出した後、超音波破砕で断片化⇒Avidin結合磁気ビーズで精製⇒シーケンス解析…と同じ手順を踏んでいます。 この実験に限ってはintactness以外の理由で手法を使い分けているのではないかと考えております。 おおさま ＞特定のDNAをビオチン修飾」という事なので（方法論が想像つかないけど）、ほとんどのDNAは修飾されていないわけで、たとえば５０ｋｂｐのフラグメントの１ｋｂｐがビオチン化されていても残りの４９ｋｂｐの挙動の影響が大きいので収量に大きな違いが見れるようには思わないです。 確かにその通りかと存じます。 ご指摘の通り、まずはビオチン化の効率が悪い可能性を検討したいと思います。 また、「案ずるより生むが易し」かとも思いますので、先行研究に倣ってスピンカラムを用いない方法で回収し、断片化＆Avidin精製した後、収率を比較してみます。

(無題) 削除/引用 No.11559-3 - 2023/06/28 (水) 08:14:50 - おお ビオチン化の効率が悪かったという事はないのでしょうか？ 「特定のDNAをビオチン修飾」という事なので（方法論が想像つかないけど）、ほとんどのDNAは修飾されていないわけで、たとえば５０ｋｂｐのフラグメントの１ｋｂｐがビオチン化されていても残りの４９ｋｂｐの挙動の影響が大きいので収量に大きな違いが見れるようには思わないです。 ビオチン化したプローブをシリカメンブレンを使ったクリーンキットで精製するプロトコールもあるようだし（こっちのほうがビオチンの影響が大きいはず）、イオン交換をつかった精製法ならリン酸の負電荷を利用するのでこちらもあまり関係なさそうだと思えます。

(無題) 削除/引用 No.11559-2 - 2023/06/27 (火) 10:37:13 - G25 ビオチン化や回収率との関連性はわからないけど、 DNA精製に関して両者、大きく異なることに、DNAの断片化の程度があると思います。 カラムで取ったゲノムDNAは、おそらく数十kb以下に断片化しますが、PCI抽出で丁寧に取ったゲノムDNAはおおよそ100 kbかそれ以上の長さを残せて、よりintactと言えます。 >同じ論文中でも「細胞核内でビオチン修飾⇒DNA抽出」ではスピンカラムを用いずに回収し、「細胞核からDNA抽出⇒ビオチン修飾」ではスピンカラムを用いて回収しており、 DNAの取り方の違いはラベルをするタイミングによるのではなく、それぞれの実験で要求されるintactnessの違いなんじゃないかなとも思います。

ビオチン修飾DNAのスピンカラムを用いた精製 削除/引用 No.11559-1 - 2023/06/26 (月) 19:20:56 - みずき いつもお世話になっております。 マウス培養細胞において、特定のDNAをビオチン修飾したのち、細胞核からゲノムDNAを回収し、Avidin結合磁気ビーズを用いて精製することを試みております。 ところが予想より収率が悪く、原因の一つにゲノムDNAの回収方法があるのではないかと疑っております。 現在、Nucleospin tissue kit（Machery Nagel社）を用いてスピンカラムでDNAを回収しているのですが、先行研究では、フェノクロ抽出＆エタノール沈殿＆ペレットをTEで溶解…というように、スピンカラムを用いない方法でゲノムDNAを回収しています。 どちらもエタ沈を利用していることに変わりはないので気にしておりませんでしたが、最近、同じ論文中でも「細胞核内でビオチン修飾⇒DNA抽出」ではスピンカラムを用いずに回収し、「細胞核からDNA抽出⇒ビオチン修飾」ではスピンカラムを用いて回収しており、明確に使い分けていることに気づきました。 ビオチン修飾DNAをスピンカラムで回収することに、私の知らない問題があるのでしょうか。 もし何かご存じの方がいらっしゃいましたらご教示いただけますと幸いです。 どうぞよろしくお願いいたします。

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