全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.11554-8 - 2023/07/04 (火) 08:48:15 - おお > > まだ質問が一つあるのですが、 > ウィルスベクターの場合は遺伝子にSV40やhTERTが細胞の遺伝子にそのまま組み込まれるため不死化すると思います。 そうですが、組み込まれたら確実に不死化するのかと言われるとそうでもないと思ってます。細胞によるかもしれません。 > > リポフェクションでそのままSV40やhTERTを細胞内に導入する場合は、CRISPERーCas9システムを使用しないので、低確率でランダムに細胞のゲノムに組み込まれるという形で細胞が不死化するという認識であっていますか。 あっています。 > > 逆にプラスミドにRosa26の配列を導入し、CRISPERーCas9システムでRosa26の領域にSV40やhTERTを入れるやり方もあるでしょうか。 やり方があるかどうかはわかりません。結構昔に不死化に関する研究から離れましたので。CRISPERーCas9の技術はLentiやRetroウイルスよりあとのもので、そのころにはウイルスベクターによる不死化は普及していましたので。 ただしアイデアとしては悪くないですね。CRISPERーCas9でのインテグレーションの効率は非常に扱いやすいCell lineで３０％前後でしょうか、、、なのでそれよりは低いと思いますが、ランダムインテグレーションよりは効率が良くなるような気もします。一つ気になるのは１あるいは２コピーだけという事ですが、、、 もし、検索してそういうやり方が見つからなかったら、通常のリポフェクションと比較するなどして、方法論として論文をかけると思いました。

(無題) 削除/引用 No.11554-7 - 2023/07/03 (月) 14:52:15 - tzｍ ありがとうございます。ウィルスベクターをそのままリポフェクションでも使用できるですね。ただうちのラボはP1なので、ウィルスベクターを使用する時点で引っかかりますので、試すは難しそうです。 ATCCのシリーズは私もいいかなと思いましたので、購入を検討させていただきます。 まだ質問が一つあるのですが、 ウィルスベクターの場合は遺伝子にSV40やhTERTが細胞の遺伝子にそのまま組み込まれるため不死化すると思います。 リポフェクションでそのままSV40やhTERTを細胞内に導入する場合は、CRISPERーCas9システムを使用しないので、低確率でランダムに細胞のゲノムに組み込まれるという形で細胞が不死化するという認識であっていますか。 逆にプラスミドにRosa26の配列を導入し、CRISPERーCas9システムでRosa26の領域にSV40やhTERTを入れるやり方もあるでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11554-6 - 2023/07/03 (月) 07:15:42 - おお 因みにレンチやレトロパッケージング用のプラスミドを直接細胞にリポフェクションなどで導入しても発現できます。興味があるならベクターのマップを見て確認してみてください 。

(無題) 削除/引用 No.11554-5 - 2023/07/02 (日) 19:06:09 - おお リポフェクタミンだからこのプラスミドというのは別にないと思いますが、、、 ATCCで不死化させるのに使っているhTERT発現プラスミドは、pGRN145のようです。 https://www.atcc.org/products/mba-141 いかの文献ではSV40T antigenのベクターとしてpSV3-neo (ATCC® 37150) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6368510/

お勧めのSV40またはTERTのプラスミドありますか。 削除/引用 No.11554-4 - 2023/07/02 (日) 01:29:07 - tzｍ ありがとうございます。ちなみにリポフェクションでお勧めのSV40またはTERTのプラスミドありますでしょうか。研究室内でいままで細胞不死化の経験なく、お勧めの物あれば、是非教えていただきたいです。

(無題) 削除/引用 No.11554-3 - 2023/06/25 (日) 19:50:51 - 独り言 リポフェクションなりで、トランスフェクションできる細胞であれば、昔から、SV40やらTERTをリポフェクションで入れて、不死化したものをとってくればよいだけです。 むしろ、不死化にウイルスベクターを用いると、不死化後の実験にウイルスベクターを利用しにくくなるから、個人的には不死化にウイルス使いたくないな。

(無題) 削除/引用 No.11554-2 - 2023/06/24 (土) 00:22:40 - おお プラスミドの発現ベクターを導入して不死化するのは普通にやられてましたけど。デメリットは導入効率と思います。

ウィルスを使わずに初代細胞を不死化する方法ありますか。 削除/引用 No.11554-1 - 2023/06/23 (金) 20:33:24 - tzｍ 現在、ラボにあるトランスジェニックマウスからアストロサイトの初代培養細胞を分離し、不死化することを考えております。 初代培養の不死化は、通常、SV40やhTERTのcDNAをコードしたウィルスベクター （プラスミド）をHEK293T に発現させ、ウィルスを回収。そしてウィルスを初代培養細胞に感染後に、セレクションによる不死化細胞を分離する方法を取ると思います。 しかしラボ内では、ウィルスを扱ったことはなく、P2にラボを改装するのも大変であるため、できればウィルスベクターを使用せずにSV40やhTERTを初代培養に導入する方法を考えておりますが、ありますでしょうか。 もしあれば、ウィルスベクターと比較した時のメリット、デメリットを教えていただければ幸いです。

全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---