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(無題) 削除/引用 No.11553-5 - 2023/06/23 (金) 21:14:34 - gbb G25さん、ありがとうございます！ 基本、3末にポリメラーゼは結合するという事ですね。 納得です、すっきりしました！

(無題) 削除/引用 No.11553-4 - 2023/06/23 (金) 15:12:32 - G25 >この酵素が二本鎖特異的に反応するなら、qPCR時にアニーリングしたプライマーの5末から削っていったりはしないのでしょうか？ ちなみに細菌のPCR用酵素は校正活性、すなわち一本鎖を削る3' exonuclease活性（正確には二本鎖も削るけどポリメラーゼ活性優位で削られてもすぐに埋め戻される）があります。 これによってフリーのプライマーは分解を受けるので、条件によってはPCRのパフォーマンスを下げる可能性があります。 たとえば反応液を準備するとき酵素とプライマーが共在している状態でモタモタするとか。 近頃の、ホットスタート酵素でMabを使っているタイプのものでは、ポリメラーゼ活性をブロックするMabだけじゃなく、exo活性をブロックするMabも加えていて、サーマルリサイクルが始まる前にプライマーの分解が起こらないようにしているのが多いようです。

(無題) 削除/引用 No.11553-3 - 2023/06/23 (金) 14:19:37 - G25 >この酵素が二本鎖特異的に反応するなら、qPCR時にアニーリングしたプライマーの5末から削っていったりはしないのでしょうか？ この5' exonuclease 活性というのは、いわゆるnick traslation活性に伴うものです。Klenow断片にしていない、完全なDNA polymase Iに代表される活性。 つまり、ポリメラーゼ活性と共役している5' exo活性です。鎖伸長を行っているポリメラーゼが進行方向にある既存の二重鎖の5'末端にぶつかったとき、これを削って進むのがこの場合の5' exo活性で、同時にその後に新生鎖を伸ばしていきます。 PCR反応で、PCRプライマーの5'側に向かって鎖伸長は起こりませんからプライマーに対して二重鎖特異的5' exo活性は作用しません。 >また、Ex taqについては、3→5エキソヌクレアーゼ活性を持ってるかと思いますが、同様にoverhangAも生じます。 このAは3→5エキソヌクレアーゼ活性により削れたりはしないのでしょうか？ 説明書にはたしか、PCR産物の末端のおよそ2/3は一塩基のdA突出末端、1/3は平滑末端（なのでTAクローニング可能）ということが書かれていはずです。 ExTaqはTaq polに校正活性（3' exonuclease活性）をもつ耐熱性ポリメラーゼ（Pwoだったかなんだったか？）をブレンドしたものですが、その配合バランスによって、そうなるんでしょう。

酵素のエキソヌクレアーゼ活性について 削除/引用 No.11553-1 - 2023/06/23 (金) 13:25:43 - gbb 酵素のエキソヌクレアーゼ活性について、ご存知の方宜しくお願いします。 Taqman probe法のqPCRに使用される酵素は、プローブを消化するための5→3エキソヌクレアーゼ活性をもってるかと思います。 この酵素が二本鎖特異的に反応するなら、qPCR時にアニーリングしたプライマーの5末から削っていったりはしないのでしょうか？ また、Ex taqについては、3→5エキソヌクレアーゼ活性を持ってるかと思いますが、同様にoverhangAも生じます。 このAは3→5エキソヌクレアーゼ活性により削れたりはしないのでしょうか？

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