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(無題) 削除/引用 No.11548-15 - 2023/06/26 (月) 09:37:13 - AAA 皆様、情報ありがとうございます。 私の実験は、候補のペプチドとタンパク質の組み合わせで、複合体を作って、それを細胞に作用させるという実験です。 論文などに使うデータというよりも、現時点ではたくさんある候補のペプチドとタンパク質のサブタイプの組み合わせで、ちゃんと複合体が形成出来ているらしいことをできるだけ簡易な系で確認したいと思っています。 差し当たってCN-PAGE、BN-PAGEは試薬を揃えたら、すぐに実行できそうなので、試してみたいと思います。 ELISAは以前試したのですが、非特異的な吸着を上手く取り除けなかったり、洗浄のステップではがれてしまうのか上手くいきましせんでした。 SPRは施設内で持っている講座を見つけて、借りれるのですが、チップや必要な試薬が高いので、今の段階で挑戦してみるかどうか二の足を踏んでいます。 HPLC、ゲル濾過は有効かもしれないと思っています。もし同様の実験のご経験がおありでしたら、いくらくらいの費用がかかったか、最初のセットアップにかかる手間、どれくらいの量のペプチドやタンパク質が必要だったかなど、ご教示いただけますでしょうか。 ペプチドの精製の目的で使うかもしれないと思い、COSMOSILのC18カラムは持っています。もし行うのであれば、施設内にHPLCの使用に詳しい方がいるので、そちらの方に手助けしていただきながら挑戦してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.11548-14 - 2023/06/25 (日) 09:45:13 - おお 否定的なことを書きましたが、どれが間違えで、正しいという事はありませんので、やるなという事ではありません。やりながら試行錯誤も科学のあり方でもありますので。 私が最初から提案している液クロなどを使った系（いろいろな方が提案されてtます）、ビアコア、あるいはELISAプレートにペプチドをトラップして、そのタンパクが吸着するか（あるいはその逆）などいろいろ結合をみる実験系は考えられますので、そういう観点からも考えてみてはと思います。

(無題) 削除/引用 No.11548-13 - 2023/06/25 (日) 09:40:23 - おお >[Re:11] AAAさんは書きました : > ありがとうございます。 > いただいた情報からだいぶ実験のイメージが固まってきました。 > > 0）使用するもの > 　ペプチド　2k(蛍光なし)、 > 　タンパク質　150k（精製されたもの）、 > 　テフコのPeptide-PAGE miniゲル > 　ATTOのBlue Nativeのサンプルバッファ、泳動バッファ > 　amershamのゲルイメージャーでCBBの可視染色を撮影 > > 1) 濃度を振ったペプチド溶液をBN-PAGEで泳動して、 > 　ペプチドのバンドのCBBの色の濃さを撮影して、濃度による検量線を作成。 > > 2) 次に > 　A. ペプチド > 　B. ペプチド+タンパク質 （モル比10当量くらい） > 　C. タンパク質 > をBN-PAGE　 > > 3)ペプチドがタンパク質と結合しない場合、泳動されたバンドは下のようになるはず。 > > 　　　　　　A　　B　　C > タンパク質　　　ー　　ー > ペプチド　　ー　ー > > 4)ペプチドがタンパク質と結合する場合、Bのレーンのペプチドのバンドはタンパク質側に吸着される分、薄くなるはず。 > あ、タンパクにペプチドが付くかどうかの実験だったのですね。ペプチド同士の相互作用とか、小さいもの同士のものをイメージしていました。 テフコのPeptide-PAGE miniゲルを念頭に入れてますが、１５０ｋDaはゲルの上部で詰まってしまってちょっと難しいんじゃないかな。 それよりも１５０ｋDaがちゃんと見れそうな系にしてそこにペプチドがあることを示すほうがいいと思います。 加えて、A、B、Cの模式図で、Bのペプチドのバンドの量が減るのを指標にしようとしてますが、それは直接的に結合したことを示していません。絶対にそこは突っ込まれて直接的なデーターが求められます。もちろんそのデーターをもとにキャンディデートを絞って、絞った後に直接的データーを示すのであればそれはありですけど。 またBNPAGEの検出感度をご存知でしょうか？おそらくマイクロｇオーダーだと思います（レゾリューション、色素の結合の割合によるでしょうけど）。１uｇのタンパクを使ったとして１：１でついていたとして１０ｎｇ強ですよね。それでその１０倍ぐらいを入れるとして１００ｎｇつかって１０ｎが結合してフリーは１００ｎｇが９０ｎｇになったという話ですが、１：１の結合とは考えてないのでしょうか。１：１ならペプチドが減るとしても測定誤差範囲に埋もれてしまうと思います。検出感度についてはやってみないとわからない点も多いかと思いますが、１uｇのタンパクの１０倍ぐらいはいるかもしれません。 わたしなら、まずはSDSPAGEで１５０ｋDaが見れる系SDS非存在下で泳どうします。サンプルバッファーはBNやCNバッファーを適用してもいいでしょうそちらのほうが負電荷を加えられるので泳動がうまくいく可能性が高いです。 あるいはDNAとたんぱくの結合をみるゲルシフトアッセイのような実験系を組みます。その場合確かにペプチドの移動度が気になるところですが、移動度が違うなら結合は見られます。 またラベルしていないペプチドを検出するには２Dに展開してペプチドを見るのが直接的かと。もしそのペプチドに対する抗体があるなら抗体をつかうか。抗体で認識できるようなタグをつけるのもありかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11548-12 - 2023/06/25 (日) 07:54:37 - あの 成功されることをお祈りします。 ですが、ペプチドの大きさが気になります。 ペプチドを結合したタンパクと、未結合のタンパクの泳動度には違いが無いのでしょうか？ そちらも定量した方がいいと思います。 それから、当方なら、標識ペプチドを有効活用するゲル濾過も試みます。 これは論文投稿後にレフェリーも追加データとして要求するかも知れないです。 既にお持ちの蛍光標識でダメなら、ビオチン標識、 もし可能ならラジオアイソトープの125I標識の蛍光量や、放射線量の グラフの二つのピークがどうなるかも見せられたら、説得力が増すと思います。

(無題) 削除/引用 No.11548-11 - 2023/06/24 (土) 22:40:37 - AAA ありがとうございます。 いただいた情報からだいぶ実験のイメージが固まってきました。 0）使用するもの 　ペプチド　2k(蛍光なし)、 　タンパク質　150k（精製されたもの）、 　テフコのPeptide-PAGE miniゲル 　ATTOのBlue Nativeのサンプルバッファ、泳動バッファ 　amershamのゲルイメージャーでCBBの可視染色を撮影 1) 濃度を振ったペプチド溶液をBN-PAGEで泳動して、 　ペプチドのバンドのCBBの色の濃さを撮影して、濃度による検量線を作成。 2) 次に 　A. ペプチド 　B. ペプチド+タンパク質 （モル比10当量くらい） 　C. タンパク質 をBN-PAGE　 3)ペプチドがタンパク質と結合しない場合、泳動されたバンドは下のようになるはず。 　　　　　　A　　B　　C タンパク質　　　ー　　ー ペプチド　　ー　ー 4)ペプチドがタンパク質と結合する場合、Bのレーンのペプチドのバンドはタンパク質側に吸着される分、薄くなるはず。 5)ペプチドのバンドを定量化して、検量線に当てはめて、タンパク質に結合した量を算出。 撮影したバンドの濃さをちゃんと定量化できるか若干心配ですが、 amershamのゲルイメージャーで可視染色の撮影は可能で、 内蔵ソフトかImage Jで処理すれば可能ではないかと思います。 今回の配列は蛍光ラベルを付けたペプチドを持っているのでCN-PAGEで蛍光強度測定でもよいのですが、いくつか候補配列があり、それらで同様の実験を行うことを考えると蛍光ラベルなしでBN-PAGEでうまくいけば最良と考えています。

(無題) 削除/引用 No.11548-10 - 2023/06/24 (土) 13:22:44 - egeria >BN-PAGEの場合、CBBバンドの濃淡で半定量的に目的のタンパク質やペプチドの多い、少ないを判断できますか？ cell lysateみたいな混ざりものではなく精製タンパク質を使うなら可能だと思います。ただ、文章を読む限り、ペプチドと結合していない遊離タンパク質のバンドも現れるように思われますが、複合体と遊離タンパク質は分離できるほど分子量が離れているのでしょうか？　重なったバンドは定量できなくなりますよね。 蛍光標識ペプチドなら複合体と遊離タンパク質が重なっていても問題なく検出できますから、遊離ペプチドと重ならなければいいはずです。その意味ではfluorescence-detection size-exclusion chromatographyをやるのがシンプルではあります。 >BN-PAGEの場合、ペプチドそのものではなくて、その周りに存在しているCBBのバンドを見ていることになるので、ペプチドの存在量を正しく反映するわけではないのかな？と、ふと思いました。 これはその通りです。複合体バンドのCBBのシグナルはほとんどタンパク質に由来するでしょうから、複合体のバンドの濃さと遊離ペプチドのバンドの濃さを直接比較することに意味はありません。

(無題) 削除/引用 No.11548-9 - 2023/06/24 (土) 12:29:22 - AAA egeria様 ありがとうございます。BN-PAGEの場合、CBBバンドの濃淡で半定量的に目的のタンパク質やペプチドの多い、少ないを判断できますか？ 例えば今回、計画しているように、ペプチド溶液にタンパク質を混ぜて泳動したら、複合体を形成する分、フリーのペプチドのバンドは薄く検出されるかと考えています。 蛍光をペプチドにつけた場合、確実に蛍光1分子に対して、ペプチド1分子なので、半定量的な判断ができるのではないかと思うのですが、 BN-PAGEの場合、ペプチドそのものではなくて、その周りに存在しているCBBのバンドを見ていることになるので、ペプチドの存在量を正しく反映するわけではないのかな？と、ふと思いました。 ご教示よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.11548-8 - 2023/06/24 (土) 08:11:59 - AAA おお様 ありがとうございます。 今、出先で、アブストラクトしか読めないのですが、 おそらく横型のポリアクリルアミドゲルを作成して、真ん中にレーンを設けておいて、 サンプルをアプライして泳動すると、 ＋に荷電したものは陰極側に、 −に荷電したものは陽極側に流れていくという原理でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11548-7 - 2023/06/24 (土) 02:05:37 - おお https://analyticalsciencejournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/elps.11501301137 こんなのもあるね。

(無題) 削除/引用 No.11548-6 - 2023/06/24 (土) 01:33:26 - egeria CN-PAGE後に蛍光スキャンするというのは光合成の研究でよく行われます。"photosystem CN-PAGE"で画像検索するといろいろ出てくると思います。BN-PAGEをやるとCBBを完全に抜くことが難しいので、こちらで蛍光スキャンは普通行いません。BN-PAGEの検出はCBB染色かウェスタンブロッティング、あるいはオートラジオグラフィー(RI標識の場合)くらいです。 CN-PAGEのほうが使える検出法が多いですが、ではBN-PAGEを使うメリットは何かと言うと、BN-PAGEのほうがタンパク質間相互作用が保たれる傾向にあるという点です。とくに膜内で相互作用するタイプの複合体はBN-PAGEが向いている場合が多いと言われます。（もちろんそうでない場合もあります） >ひとつ気になったのは、こちらの広告の一番上の模式図が4つ並んだところを見てみると、HR-CN-PAGE、BN-PAGE、Native PAGEで分子量の小さいものが一番手前（上）にきて、分子量の大きな複合体が一番遠いところ（下）に来ているように見えます。 これはAttoのミスだと思います。分子量が大きいほど移動度は低下します。

(無題) 削除/引用 No.11548-5 - 2023/06/23 (金) 13:20:13 - AAA 情報ありがとうございます。 ATTOのHR-CN-PAGE、BN-PAGEバッファ ttps://www.atto.co.jp/content/download/9903/154113/file/%E7%B0%A1%E6%98%93%E5%BA%83%E5%91%8A_Native%20series_221004(%E3%83%AA%E3%83%B3%E3%82%AF%E5%9F%8B%E8%BE%BC%EF%BC%89.pdf たしかにこれなら、複合体もフリーのペプチドもマイナスに荷電させて、泳動できるので、電極を逆にしたりしなくても、いいかもしれません。 しかもBN-PAGEを使えばもしかすると、蛍光標識していないペプチドでも使えるかもしれないと思いました。 ひとつ気になったのは、こちらの広告の一番上の模式図が4つ並んだところを見てみると、HR-CN-PAGE、BN-PAGE、Native PAGEで分子量の小さいものが一番手前（上）にきて、分子量の大きな複合体が一番遠いところ（下）に来ているように見えます。これはたまたまプラス荷電した分子を小さく、マイナス荷電した分子を大きく描いてしまったために、こうなっただけでしょうか？ Native PAGEではタンパク質の荷電が影響するため、SDS-PAGEのように分子量の順には分離されない、というのは分かるのですが、 HR-CN-PAGE、BN-PAGEでは分子量が大きいほど遠くまで泳動されたりするといったことはありますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11548-4 - 2023/06/23 (金) 02:38:50 - おお ＞１．Natige PAGEのゲルとして、ATTOなどはTris-Gly系を推奨していますが、Tris-HClでも可能でしょうか？ Tris-Gly系のゲル中のバッファーはTris-HClです。スタッキングにTris-HCl、ｐH６．８、分離ゲルはTris-HCl　ｐH８．８を使っています。プレキャストゲルの場合アクリアミドが高いｐHで徐々に分解していくので、中性付近のTris-HClに改変したものもあります。まあそれでも泳動そうのバッファーはTris-Gly系を使っているのかなぁと思いますが、調べてみてください。 ＞２．Native PAGE用の泳動バッファはメーカーによって、 どんなバッファーシステムを使っているのか具体的によくわかりませんのでお答えできません。たとえばTris-Tricineを使った系では、アノード、カソードバッファーが違いますが、同じバッファーをつかう変法があるけど、分解能はいまいち。 ＞３．今回ペプチドがかなりプラスに荷電しているものを使うため、泳動のさいには電極のプラス、マイナスを逆にして バッファーシステムによりますが、陰イオン、陽イオンの流れを巧みに利用しているケースも結構あるので、単純に逆にしてうまくいくような気がしません。まあそれでもというならやってみてもいいのかもしれません。 ATTOのCNPAGE用のバッファーセットはデオキシコール酸が入っていてそれがたんぱくに結合して負に電荷させるようにしています。その理屈でいけば（ペプチドでどの程度有効かわかりませんが）そのまま活用してもいいでしょう。 プラス、マイナスを逆にする例として正電荷アミノ酸が多いヒストンやHMGでやられているものがあります。 https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/4073495/ これは変性状態での解析ですがバッファー系は参考になるかもしれません。 もっと単純にかんがえると、例えばDNAなどはゲルも泳動そうのバッファーもTAEとかTBE。同じようにペプチドもゲルの網が詰まったものなら理屈では分けられるはずです。またゲルシフトアッセイではゲルも泳動そうもTris-Glyです。こういうのなら逆に流してもそんなに変にはならないように思いますし、 まあ最適化があれこれ必要な気もしますから、HPLCでゲルろ過とか考えたほうが単純かもしれませんよ。

(無題) 削除/引用 No.11548-3 - 2023/06/22 (木) 22:42:03 - qq clear native electrophoresisというのがある。 BN-PAGEだと蛍光を検出できそうにないですね。

(無題) 削除/引用 No.11548-2 - 2023/06/22 (木) 22:24:18 - gbふ 基本的に不連続緩衝系で蛋白質を濃縮する原理はSDS-PAGEと同じとおもうので、Running buffer はTris-glycine でgel bufferはTris-HCl pH6.8と8.8であることは重要ではないでしょうか。もともと、Native PAGEが先に開発されて長くつかわれてたのを、レムリという人がそれにSDS入れてみた　みたいにしてSDS-PAGEができたと大学の時習いました。

Native PAGEの泳動バッファについて 削除/引用 No.11548-1 - 2023/06/22 (木) 17:56:49 - AAA 　いつも勉強させてもらっています。 　今回、Native PAGEで電気泳動を行おうと思っております。 　蛍光標識をつけたペプチドとタンパク質の複合体の形成の効率を見るのが目的です。 　複合体化した場合には、ペプチド単独で泳動した場合と比較して、フリーのペプチドのバンドの蛍光強度が低下して、検出されるのではないかと考えています。 　蛍光標識ペプチド、テフコのペプチド用のプレキャストゲル（Peptide-PAGE mini、組成はTris-HCl。SDS不含）は手元にあります。 　このペプチドとゲルの組み合わせはSDS-PAGEではきちんと機能することは確認しています。 　これまでNative PAGE電気泳動は行ったことがなく、サンプルバッファ、泳動バッファはSDS含有のものしか持っていません。新たに購入しようと思っています。 そこで質問なのですが、 １．Natige PAGEのゲルとして、ATTOなどはTris-Gly系を推奨していますが、Tris-HClでも可能でしょうか？ ２．Native PAGE用の泳動バッファはメーカーによって、単一のものと、陽極用と陰極用で分かれている物を見つけたのですが、これらの違いによって分離能が変わってきたりしますか？ ３．今回ペプチドがかなりプラスに荷電しているものを使うため、泳動のさいには電極のプラス、マイナスを逆にして泳動するのがよいかと思っています。その場合に、陽極用と陰極用で分かれているバッファを使うのであれば、バッファも逆にする必要がありますか？ よろしくお願いいたします。

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