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(無題) 削除/引用 No.11546-8 - 2023/06/23 (金) 10:52:00 - sai 2MEさん ご丁寧な解説ありがとうございます。 今回の回答を通じて、自分の実験におけるプロトコール選択についての考え方がより明確になりました。ご指摘いただいた点を念頭に置いて進めていきたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.11546-7 - 2023/06/23 (金) 09:32:50 - 2ME コンピが優秀というのではありません。室温1分プロトコールではコロニーが10個ぐらい生えるだけ。私はこれで事足りる実験だから室温1分プロトコールにしているという、ただそれだけのことです。 高い形質転換効率を求める場合は、室温1分プロトコールではダメですよ。 形質転換に限りませんが、質問者の実験目的に合わせてプロトコールをお考えください。

(無題) 削除/引用 No.11546-6 - 2023/06/23 (金) 09:27:36 - 2ME 前培養が不要なのはアンピシリンの場合。アンピシリンは細胞壁合成阻害剤だから、翻訳は止まらない。すなわちアンピシリンが存在しても、アンピシリン耐性遺伝子を導入されたばかりの大腸菌でも、アンピシリン耐性遺伝子からアンピシリン耐性遺伝子産物（βラクタマーゼ）を作ることができる。だから前培養しなくても形質転換した大腸菌は増えることができる。 一方、カナマイシンは翻訳を止める。すなわちカナマイシンが存在する場合、カナマイシン耐性遺伝子を導入されたばかりの大腸菌は、カナマイシン耐性遺伝子産物（カナマイシンキナーゼ）を作ることができない。翻訳が止まっているから。だからカナマイシン耐性遺伝子を導入されたばかりの大腸菌の中で、カナマイシンキナーゼが一定程度作られるまでは、カナマイシンを入れずに前培養しないといけない。テトラサイクリンも同様。

(無題) 削除/引用 No.11546-5 - 2023/06/23 (金) 08:56:50 - sai 2MEさん ご回答ありがとうございます。 昨今のコンピテントセルは優秀ということでしょうか。その様な手法でも形質転換は正常に進行するのですね。もはやサーマルサイクラーすら要らないですね。 前培養が不要というのは、寒天培地上で前培養とコロニーの生育を纏めているからでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11546-4 - 2023/06/22 (木) 21:16:16 - 2ME 済なので書いても読まれないと思いつつ。 形質転換効率を気にせず、かつ、選択マーカーがアンピシリンの場合： コンピを室温で融かして、DNA溶液を入れて、室温1分間放置してプレートに蒔くだけで終了。 氷もヒートショックも前培養（後培養ともいう）も不要。

(無題) 削除/引用 No.11546-3 - 2023/06/22 (木) 18:47:22 - sai G25さん 詳細なご回答ありがとうございます。 形質転換効率に拘らなければ想像以上にプロトコルを改変しても良さそうですね。氷中という表現も正確には何℃なのかわからず困っていました。 ご指摘の通り氷くらい用意すべきなのでしょうが、人間を排して機械のみで実験を構築したいので取り扱いの困難な氷を避けたかったという背景がございました。お陰様で最小限の設備で対応できる可能性を見出せました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.11546-2 - 2023/06/22 (木) 17:33:12 - G25 ファルコンチューブを使うというのは、たぶん大昔、先駆者のHanahanあたりがそれじゃなきゃ効率が激減するのでだめ、と言っていたからですけど、 いまじゃエッペンチューブなんかでやるのが普通になっていると思います（形質転換がうまくいかなかった時代、試行錯誤の末の経験則に基づくmythが多くて、今から見るとナニソレっていうことも多々ある）。 で、エッペンチューブでやる場合、ヒートブロック型のチューブインキュベーターを使っているところが多いと思います。なのでサーマルサイクラーをその代わりに使うというのは大差ないでしょう。 ただ、ヒートショックだけでなく氷冷までやるというのは、成績の良し悪しは置いておいても、作業上のメリットがないんじゃないですか？　そうすることの、なにが良いのでしょうか。 (4)の氷冷でしばらく放置するのは形質転換効率を上げるのに効果がありますが、省略しても効率が下がるだけです。そして多くの場合、効率が低くたって目的は達せられます。ここで氷水浴を準備するのを省きたいというなら、コンピを室温で溶かして直ちに形質転換に進んだっていい。氷くらい準備しろよっとは思いますけど。 (6)の氷冷は必要ありません。しなくたって劇的に効率が変わるわけでもない。わざわざサーマルサイクラー使ってまで冷却するほどの意味ないでしょう。ヒートショックのあと直ちに液体培地を加えればよろしい。培地の温度も氷温、室温、37℃、どれにしたって劇的に効率が変わるわけでもない。

サーマルサイクラーを用いた形質転換 削除/引用 No.11546-1 - 2023/06/22 (木) 15:35:24 - sai お世話になります。形質転換についてご相談させてください。 以下にタカラバイオ株式会社の形質転換のプロトコルを示しており、工程4〜6では氷とインキュベーターによりヒートショックを行っています。それが一般的な手法であることは存じているのですが、仮にサーマルサイクラーのような装置で温調を代替することは可能でしょうか。 目標温度に達するまでタイムロスがあり急冷や急温できないとは予想できますが、実際に試したことがあるかがおられましたらご教示をお願いいたします。 （1） TaKaRa Competent Cells BL21 を使用直前に、氷中で融解する。 （2） 融解したら、穏やかに混和して均一にし、100 μlのコンピテントセルを14 ml丸底 チューブ（ファルコン・ラウンドチューブ等）に移す（ボルテックスは用いない）。 （3） 形質転換するDNAを加える（10 ng以下が望ましい。液量は10 μl以下とする。） （4） 氷中、30分間放置する。 （5） 42℃で45秒間インキュベートする。 （6） 氷中1〜2分間放置する。 （7） あらかじめ37℃に保温しておいたSOC Mediumを最終1 mlになるように加える。 （8） 37℃で1時間振とうする（160〜225 rpm）。 （9） 薬剤を含むL-brothプレートに適当量まく＊。 （10） 37℃で一晩放置する。

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