こんちには。cloningです。
pETへのクローニングの実験で行き詰っているので、質問させていただきました。
只今、とある遺伝子をpET-16bのNde1およびBamH1間にクローニングする実験を行なっております。
一般的な方法 (下参照) に則り、行いましたが、形質転換体を得ることができませんでした。
方法
インサートはPCRにより増幅し、カラム精製後、制限酵素処理 (37度、約2時間)。
制限酵素処理後、電気泳動を行なうゲル抽出した。これをインサートDNAとして
用いた。
pET-16bは、制限酵素処理後、電気泳動を行ないゲル抽出。抽出したDNAに対して、
脱リン酸化 (念のため) を行ない、カラム精製した。これをベクターDNAとした。
インサートDNAおよびベクターDNAを混合し、T4 DNA Ligaseによりライゲーション
(16度、2時間程度)。反応後、Dh5aに形質転換。
以上を踏まえで、制限酵素による切断有無、ライゲーションの有無を評価するために、
・以下の実験を行ない、表記の結果になりました。。
pET-16bに対して、Nde1シングル、BamH1シングル、Nde1-BamH1ダブルで作用させ、
それぞれで切断されていることを確認。これらそれぞれに対して、T4 DNA Ligaseを
16度で2時間作用させると、その後のアガロースゲル電気泳動よりBamH1シングルでは
ライゲーションされた形跡があるが、Nde1シングルではライゲーション前のサンプルと
泳動パターンに変化なし。
・PCR増幅したインサート (足場配列は6塩基) に対して、Nde1シングル、BamH1シングル、
Nde1-BamH1ダブルで作用させ、これらそれぞれに対してT4 DNA Ligaseを作用させ
(16度または4度で最大16時間程度)、その後のアガロースゲル電気泳動より分析した。
その結果、BamH1シングルおよびNde1-BamH1ダブルではインサートダイマーが生成しているが、
Nde1シングルでは生成なし。
ちなみに、pET-16bのNde1-BamH1 siteを用いたクローニングを行なっている論文はありました。
以上の結果より、形質転換体が得られない原因として何か考えられることはありますでしょうか。 |
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