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(無題) 削除/引用 No.11542-21 - 2023/06/23 (金) 11:40:21 - G25 >最新のだと最低3塩基あればいいようです。mothodologyが変わったらしいけど何が違うのだろう？ 挙げられたリンク先に Cleavage Close to the End of DNA Fragments (oligonucleotides) and Cleavage Close to the End of DNA Fragments (linearized vector) と古いデータのpdfへのリンクがありますが、 後者はクローニングサイトを二重消化するときを想定して、第一のサイトで切ったあと、切断末端にくる隣のサイトで切るときの効率に関するデータ。 前者は合成オリゴをアニールした二重鎖を基質として、前後に足場の数と制限酵素の消化効率を調べたもの。 現在、表店に出てるのは、実際にPCRプライマーにサイトを設定してPCR産物を基質としてアッセイしているデータで、オリゴを基質としたデータとは多少、齟齬があります。 おそらく制限酵素のカイネティクスはミカエリスメンテンモデルのように、酵素と基質がそれぞれ粒子のように衝突する（基質がオリゴの場合に相当）というのではないので、ある程度長さのあるPCR産物を基質にしたほうが切れやすいからだと思っています。制限酵素の反応過程には、配列非特異的にDNAに結合して鎖の上を走査して認識配列に至るという過程が含まれるといわれていますね。

(無題) 削除/引用 No.11542-20 - 2023/06/23 (金) 11:04:17 - Nanashi >[Re:15] 774Rさんは書きました : > NEBの古いカタログにオリゴDNA2本鎖の切断活性が出てますね。 > 6塩基の追加では切断効率0%となってます。 > 7塩基目から活性が出てくる。 最新のだと最低3塩基あればいいようです。mothodologyが変わったらしいけど何が違うのだろう？ ttps://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/cleavage-close-to-the-end-of-dna-fragments

(無題) 削除/引用 No.11542-19 - 2023/06/23 (金) 10:31:44 - G25 Nde1は切断効率や再結合に難があるというのはよく知られてもおり、また実際に経験していることも多いかと思います。 こんな使いにくい酵素がクローニングサイトに設定されているのは、 Nde1は認識切断配列にATGを含むので、導入遺伝子の開始コドンを活かす形でベクターにいれるのに重宝というだけで、そうでないなら固執する必要は全く無いでしょう。C末タグ融合で翻訳開始は組み込んだ遺伝子の開始コドンからというならともかく、N末タグ融合で翻訳開始はタグからというなら必然性はないですね。 別のサイトがあるなら最初からそっちを選んでもいいくらい。

(無題) 削除/引用 No.11542-18 - 2023/06/23 (金) 10:24:45 - G25 >その安いメーカー教えて下さい もとから安価に価格設定していところももちろんあるだろうけど、 大学なんかに対しては特価を設定している（お得意様割引きやボリュームディクカウント的な）メーカーもあります。その大学に所属していれば無条件で適用される特価です。そういうのは全顧客一律ではなく大学や業者によって異なるので、出入りの代理店にでも聞くなり相見積もりをだしてもらうなりするのが良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.11542-17 - 2023/06/23 (金) 09:40:39 - おお >[Re:15] 774Rさんは書きました : > NEBの古いカタログにオリゴDNA2本鎖の切断活性が出てますね。 > 6塩基の追加では切断効率0%となってます。 > 7塩基目から活性が出てくる。 どうしても今ある状況でこれを何とかしたいなら、PCRフラグメント末端をリン酸化してコンカテマーというかPCRフラグメントが連なったものを作り、Ndeできるというても取れなくは無い。

(無題) 削除/引用 No.11542-16 - 2023/06/23 (金) 08:58:51 - み >[Re:13] AAさんは書きました : > 今は合成オリゴは1塩基10円ちょっとくらいなので、プライマーを数本作り直すだけならかなり安価です。(制限酵素配列＋末端おまけ＋鋳型相補配列で30塩基だったとして1本数百円) その安いメーカー教えて下さい

(無題) 削除/引用 No.11542-15 - 2023/06/22 (木) 12:14:32 - 774R NEBの古いカタログにオリゴDNA2本鎖の切断活性が出てますね。 6塩基の追加では切断効率0%となってます。 7塩基目から活性が出てくる。

(無題) 削除/引用 No.11542-14 - 2023/06/22 (木) 11:27:46 - cloning AA様、回答ありがとうございます。 > ligation試薬側が古かったりして活性が下がっているなどの可能性はないでしょうか？ Ligation試薬は1、2年前に購入したものでそこまでは古くはないと思いますが、安定剤のBSAが沈殿してしまっているので、もしかすると活性が下がっているのかもしれません。2塩基や3塩基突出末端のライゲーションには問題ないが、Nde1のような1塩基突出末端のライゲーションには影響が出る程度に。 > 酵素を繰り返し使うほうがコスト上がっちゃうので早めに切り替えて言っていいと思います。 そうですね。同研究室の他研究者がシームレスクローニングを使用していて、問題なくクローニングできていたので、いっその事プライマーを再設計するなら、そちら様に設計しようかとも考えております。

(無題) 削除/引用 No.11542-13 - 2023/06/22 (木) 11:16:58 - AA 制限酵素については既に皆様ご指摘のとおりではないかと思います。 あと他にあるとすればNdeIは突出部位が短くて繋がりにくいので、基本的には平滑末端と同様に取り扱ったほうがいいと思います。 ligation試薬側が古かったりして活性が下がっているなどの可能性はないでしょうか？ >>まとめて注文してしまい、総額数万 今は合成オリゴは1塩基10円ちょっとくらいなので、プライマーを数本作り直すだけならかなり安価です。(制限酵素配列＋末端おまけ＋鋳型相補配列で30塩基だったとして1本数百円) 酵素を繰り返し使うほうがコスト上がっちゃうので早めに切り替えて言っていいと思います

(無題) 削除/引用 No.11542-12 - 2023/06/22 (木) 11:14:58 - cloning おお様、qq様回答ありがとうございます。 おお様が指摘されたNde1によるヌクレオチドの除去が気になったので、 取り合えず、それについて検証してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.11542-11 - 2023/06/22 (木) 11:12:08 - cloning のなめ様回答ありがとうございます。 > NdeI認識配列が含まれるプライマーの、NdeI認識配列より5'末端側に数塩基足さないとほとんど切れませんが、付け足していますか？ 6塩基付加しております。

(無題) 削除/引用 No.11542-10 - 2023/06/22 (木) 11:00:56 - qq 思いつき程度の事しか言えないんだけど、PCR断片の切断がうまくいっていないのではないかと想像します。 １）ｐETのNde/Bam切断の準備では、切りにくそうな方の酵素で切断・ゲル抽出して、切り出した後、もう一つの酵素で十分切断・抽出します。脱リン酸はしない方が良いと思います。 ２）確実にNdeI/BmaHIで切断されている断片を何かから用意できるとよいですね。pCMVベクターのCMVプロモータ中にNdeIがあるので、NdeI/BamHIで適当な断片を得られるかもしれません。その適当なNdeI/BamHI断片がクローニングできるのであれば、逆にPCR断片の切断がうまくいっていないのだろうと想像します。 ３）PCR断片を、pGEMT-easyにクローニング（もしくはNde/Bamなしのvectorにbluntクローニング）して、そこからNdeI/BamHIで切り出すほうが早いかなと思います。

(無題) 削除/引用 No.11542-9 - 2023/06/22 (木) 10:57:22 - のなめ NdeI認識配列が含まれるプライマーの、NdeI認識配列より5'末端側に数塩基足さないとほとんど切れませんが、付け足していますか？ 3塩基ほど足せばクローニングには問題ないくらい切れるようになります。

(無題) 削除/引用 No.11542-8 - 2023/06/22 (木) 02:03:24 - おお Nde Iで切った後、ブラントにして、BamHIできって、インサートはBamHIだけで切ったものでLigationするとフレームは合いますか？足場６塩基だとならないか、、、ブラントでなくてNdeIの部分をTAだけをTAにしてもならないか、、、んインサートとプラスミドをNdeIで切ってから平滑にしてインサート、プラスミドをTAクローニングの要領でつなげるとフレームはあうな。 XhoかBamHIの位置でブラントでいれてできたプラスミドからNdeIで余分な部分を切り出すとか。 NEBのNdeIの説明をみると、 https://www.neb.com/faqs/2011/12/22/ndei-seems-to-be-digesting-my-dna-correctly-but-when-i-try-to-ligate-it-i-obtain-no-colonies-is-t NdeI is a very robust enzyme. If the substrate DNA is digested for extended periods of time, we have found evidence that the enzyme will remove some additional nucleotides. Digestion of DNA with NdeI over 4 hrs is not recommended. 上記の記述を信じると、 インサートは数％でも切れていたらいいから短時間で済ましてOKですし、プラスミドはNdeI処理をミニマムにして切れたものをゲルから切り出せばよいので（そのあとにBamHI処理かな）、そのようにしてLigationするといいのかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.11542-7 - 2023/06/22 (木) 01:34:21 - cloning > ndeの至適条件で酵素反応されているのでしょうか？ はい。 使用している制限酵素はタカラバイオのNde1とBamH1で Hバッファー、37℃でインキュベートしています。 > 単に実験に不慣れで全ての工程の効率が悪くなっているだけにしか聞こえない。 別制限酵素を使った場合は問題なくできているので、実験に不慣れということはないと思います。

(無題) 削除/引用 No.11542-6 - 2023/06/22 (木) 00:53:53 - 苦労人 >[Re:5] cloningさんは書きました : >> 一部、Nde1を使用しない様に設計しましたが、全く同じ方法で実験したらそちらは一応形質転換体は得られているので、おそらくNde1が原因だと考えていました。 ndeの至適条件で酵素反応されているのでしょうか？ コロニーが出る出ないの勝負をされているレベルでは単に実験に不慣れで全ての工程の効率が悪くなっているだけにしか聞こえない。インサートサイズが大きくなるとたちまち入らなくなる人いますから。

(無題) 削除/引用 No.11542-5 - 2023/06/21 (水) 23:39:49 - cloning 全部はまだやっておりません(3割ぐらい)。 ほとんどはNdeを使用する様に設計しました。 一部、Nde1を使用しない様に設計しましたが、全く同じ方法で実験したらそちらは一応形質転換体は得られているので、おそらくNde1が原因だと考えていました。

(無題) 削除/引用 No.11542-4 - 2023/06/21 (水) 23:27:18 - あああ ＞いくつかの遺伝子があって、まとめて注文 クローニングは全部うまくいかないのですか？それとも特定の遺伝子だけですか？ 全部うまくいかないならプロトコールか設計したプライマーに問題があると思います。

(無題) 削除/引用 No.11542-3 - 2023/06/21 (水) 21:25:01 - Cloning あああ様 回答ありがとうございます。 やはり、プライマー作り直した方がいいですね。 ただ、他にもいくつかの遺伝子があって、まとめて注文してしまい、総額数万だったので、 躊躇していました。 あと、遺伝子中にXho1 siteもあったような気がするので、 プライマーを変えるとしたらシームレスクローニング用にしようと考えています。

(無題) 削除/引用 No.11542-2 - 2023/06/21 (水) 21:02:22 - あああ 質問の答えでなくてすみませんが、 NdeIをやめて、プライマーを作り直してBamHIかXhoIに入れましょう。 入らない時は入らないし、NdeIは入りにくいので、さっさと別のサイトに入れて作ってしまった方が時間が節約できます。タンパク発現などの次のステップをやりながら、なんで上手くいかなかったのか考えた方が効率的だと思います。

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