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(無題) 削除/引用 No.11536-11 - 2023/06/19 (月) 19:08:15 - TF SYBRmasterさま、G25さま ありがとうございます。 SYBRmaster様のいうように、T7プロモーター配列の3'末端はGGGでこのGから転写が始まるから、どうしても5'末端にGGGが付加されるのですね。理解できました。 また、polyAに関しては、鋳型にもともと付加する場合は、長さの担保が可能でよさそうですね。 お二人ともありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.11536-10 - 2023/06/19 (月) 00:37:02 - SYBR master >[Re:9] G25さんは書きました : > 　質問者の示したリンク先のBEXは違う手法だということですか？ BEXのモノについてはよく解らないです(そもそも、そこには外注していないし、今後もしないと思います)。 ただ、Poly Aの長さがmRNAの品質(この場合、たぶん半減期？）に影響しているとの論文が有る状態(長さについては多数の異論があるのは知っているし、今回の約100baseも過去データからこれなら多分非確定安定だし、すぐに作れる長さはこれだよね、で決まったと思っています)で、poly Aの長さが「よくわかりません or 適当です」では、外注先としてはマイナスなイメージでは無いでしょうか(mRNAワクチンの後で、特に医薬品等を目指すのであれば)。 もしBEXがpolyA polでmRNA合成していたら、今後QCが取れないので、例え実験で良い結果が出ても、医薬品の申請はほぼ不可能だと個人的には思います。

(無題) 削除/引用 No.11536-9 - 2023/06/18 (日) 23:47:29 - G25 > 最近は、この方法だとpolyAの長さが調整できないので、polyA polは余り使われません。 　質問者の示したリンク先のBEXは違う手法だということですか？

(無題) 削除/引用 No.11536-8 - 2023/06/18 (日) 23:35:36 - SYBR master >[Re:4] G25さんは書きました : > poly Aはin vitro 転写 後にE. coli poly A polymerase を使って付加。 最近は、この方法だとpolyAの長さが調整できないので、polyA polは余り使われません。 >[Re:5] おおさんは書きました : > Poly Aは鋳型にAストレッチを末端にあらかじめつけて、ポリメラーゼに読ませる事もありますね。 基本現在のmRNAワクチンは、この方法で作成されています。 >[Re:6] TFさんは書きました : > 別の会社のHPには、invitro合成後の5末にGGGが付加されるとありました。 > この理由について推測可能でしょうか T7 ptomoterを利用してRNAを転写した場合、promoter配列に依存して5'末端配列の塩基が固定されます。この部分は近年sgRNAやsiRNAの転写で。メーカー側で詳細に確認されています。 ref; https://international.neb.com/protocols/2015/11/24/sgrna-synthesis-using-the-hiscribe-quick-t7-high-yield-rna-synthesis-kit-neb-e2050 >[Re:7] G25さんは書きました : > 化学合成した鋳型を使う製法なので、多分、鋳型DNAを合成する都合だと思う。 なので合っています。

(無題) 削除/引用 No.11536-7 - 2023/06/18 (日) 23:14:13 - G25 > 別の会社のHPには、invitro合成後の5末にGGGが付加されるとありました。 この理由について推測可能でしょうか？ 化学合成した鋳型を使う製法なので、多分、鋳型DNAを合成する都合だと思う。鋳型をPCRで増幅して取得するためにPCRをかけ、その時に下流プライマーにcccのtailを付加しているのじかもしれない(例えばプロモーター配列を付加する上流プライマーとバランスを取るために)。

(無題) 削除/引用 No.11536-6 - 2023/06/18 (日) 22:42:23 - TF Ｇ25さま、おお様、ご連絡ありがとうございます。 5capと、polyAの付加は後からつけているのですね！ ありがとうございます、納得しました。 すみません、最後にもう一つだけ良いでしょうか？ 別の会社のHPには、invitro合成後の5末にGGGが付加されるとありました。 この理由について推測可能でしょうか？ https://fasmac.co.jp/genome_long_chain_rna

(無題) 削除/引用 No.11536-5 - 2023/06/18 (日) 07:28:31 - おお Poly Aは鋳型にAストレッチを末端にあらかじめつけて、ポリメラーゼに読ませる事もありますね。 RNAに結合するタンパクの認識配列を探すため、両端にタグを付けたランダムな配列のRNAをそのタンパクでプルダウンして、逆転写後T7プロモーターのタグ配列を持ったプライマーでPCR して、それを2次スクリーニング、3次スクリーニングと濃縮すると言った方法があります。SELEXって言ったかな。 鋳型はベクターでなくてもいいという事です。また、ベクターに転写したい配列を入れた場合、環状のまま転写するとベクターの配列を一部含むものができるので、MCSの酵素を利用して切ることが多いです。転写産物も途中で終わってしまったものとか除くためゲル抽出を行うことも多いし、その時、何ベース以上の全部の産物となると、どこからどこまで切り出すのかと言う話にもなる。 Capについては、実際アナログ添加してやってました。

(無題) 削除/引用 No.11536-4 - 2023/06/18 (日) 01:15:51 - G25 poly Aはin vitro 転写 後にE. coli poly A polymerase を使って付加。 in vitro 転写されたRNAに後からcapを付加するのではなく、ARCAなどのcapアナログ存在下で in vitro 転写するとcapを持つRNAができる。 https://www.nebj.jp/jp/Flyer/190116_BRO_RNA%20Synthesis_LowRes.pdf

(無題) 削除/引用 No.11536-3 - 2023/06/18 (日) 00:19:04 - TF G25様 ご教示ありがとうございます！ �@について調べたところ、ベックスという企業でT7プロモーターによる受託をやっているようなのですが、合成されたmRNAに5'capとpolyAが付加されると記載がありました。それで気になって質問したのですが、これはどういった理由かわかるでしょうか？ https://www.bexnet.co.jp/product/trust/genetic-engineering-experiment/mrna.html?yclid=YSS.1000466991.EAIaIQobChMI3MjUhczK_wIVvtpMAh0RqgbiEAAYASAAEgJTXPD_BwE

(無題) 削除/引用 No.11536-2 - 2023/06/17 (土) 22:09:01 - G25 1) されません。もちろん。 2) 直鎖でも大丈夫。T7プロモーター配列を付加したプライマーでPCRかけて鋳型をえる方法もあり。 プラスミドを鋳型にする場合、転写の終結部(ベクターとの繋ぎ目)を制限酵素で切断しておくのが普通。 3) 必要ない

T7RNAポリメラーゼによるmRNAの合成について 削除/引用 No.11536-1 - 2023/06/17 (土) 21:00:17 - TF ご存じの方ご教授お願いします。 T7RNAポリメラーゼによるin vitro転写でのmRNA合成についてになります。 下記の三点についてご教授願えますでしょうか。 �@この酵素で転写を行った場合、5'capとpolyAtalはmRNAに付加されると認識していますが、なぜ付加されるのでしょうか？T7RNAポリメラーゼは原核生物由来の酵素だと認識しており、その場合5'capとpolyAtalはつかないのではないでしょうか？ �A鋳型のDNAは、ベクターでないといけないでしょうか？PCR産物や合成オリゴのような直鎖でも問題ないでしょうか？ �B鋳型DNAの構造として、T7promoterの直下に目的の配列を配置して大丈夫でしょうか？promoterの3'末端から何bpか間に挟む必要あるでしょうか？ どうぞよろしくお願い致します。

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