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(無題) 削除/引用 No.11535-14 - 2023/06/19 (月) 22:34:00 - sample みなさんありがとうございます。 またいろいろと助言に従い、試してみます。

(無題) 削除/引用 No.11535-13 - 2023/06/19 (月) 07:30:17 - 2ME >[Re:10] sampleさんは書きました : > ちなみにサンドイッチ法の時はDMBを入れた瞬間、血清サンプルとブランクは数秒で真っ青になったため、すぐにSTOP液を入れました。すべてのウェルでほぼ同じ吸光度であったので、やはりコーディングされたRabbit ポリクローナル抗体Aにビオチン標識された？Rabbit ポリクローナルdetection抗体Bが反応しているしか思えないような気もします。。。 それは抗体Aコーティング後のブロッキングが不十分ということではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11535-11 - 2023/06/19 (月) 00:32:46 - あの フリーのビオチンが残留してそうな気がします。 それから抗体Bをコートに用いた方が良いかも。

(無題) 削除/引用 No.11535-10 - 2023/06/19 (月) 00:02:53 - sample みなさんご意見ありがとうございます。 ちなみに昨日今日でサンドイッチ法ではなく、直接法として、血清をプレートにコーディングし、その上にビオチン標識されたdetection抗体Bで反応し、吸光度を測定すると血清では吸光度は上がり、ブランクでは吸光度はほとんど上がりませんでした。 そうするとやはりdetection抗体Bにビオチンはちゃんと標識できたような気がします。。 ただ血清では吸光度は稀釈倍率に従って、曲線になっていないので、やはりサンドイッチ法によって特異性を上げて、評価が必要な気がします。 ちなみにサンドイッチ法の時はDMBを入れた瞬間、血清サンプルとブランクは数秒で真っ青になったため、すぐにSTOP液を入れました。すべてのウェルでほぼ同じ吸光度であったので、やはりコーディングされたRabbit ポリクローナル抗体Aにビオチン標識された？Rabbit ポリクローナルdetection抗体Bが反応しているしか思えないような気もします。。。 2MEさん 今回測定したい標識物質は組織免疫染色での抗体A,よび抗体Bの反応性は確認されています。しかしその標識物質は生理的な構造ではなく、一部のみ切断されて、アミロイドβ構造を作り、組織に蓄積している。標的物質の精製品はIn　vivoでは存在しません。従ってクルードで標準曲線を書こうとしています。

(無題) 削除/引用 No.11535-9 - 2023/06/17 (土) 23:42:52 - qq ビオチン標識された抗体Bと思っているものが実は標識されていないんじゃないですか、という指摘です。 内在性のビオチン化タンパク質だってABCで検出されてしまうのだから、ビオチン化抗体BもABC系で検出できるでしょう。 まあ、ポジコントしてビオチン化抗体があればそれなりに説得力はあるかもしれませんね。 標識キットの取説には抗体の準備に関して細かく説明されていない感じでしたが、トリスやアミノ酸などを除去する必要があるということです。 ビオチン化するときの抗体Bの溶液が低分子アミンを含んでいるのであれば、NHS-biotinでは殆ど標識されていないだろうなと思うのです。

(無題) 削除/引用 No.11535-8 - 2023/06/17 (土) 23:37:26 - 2ME >[Re:1] sampleさんは書きました : > しかしいざ行ってみるとブランク（血液の代わりでブッファのみ使用）も含め、すべてのサンプルで同じ吸光度になってしまいました。 ブランクの吸光度が高いということか、それともサンプルの吸光度が低いということか？ > 原因として、detection抗体Bのアビジンが抗体Bから離れて、coating抗体Aにくっついたことが想定されるかなと思います。 非特異吸着しているだけというのがもっともありそうだと思うのだが。 そもそも質問の記載だけでは、多様な原因が考えられそうだが、アビジン・ビオチンに原因を特定するエビデンスがあるのか？ あるいは他の原因をネグる実験はしてあるのか？ 標準曲線は一定の直線性があるのか？ 標的物質の精製品はあるのか？それともクルードで標準曲線を書こうとしているのか。 標的物質に対する抗体Aまたは抗体Bの反応性は確認できているのか？

(無題) 削除/引用 No.11535-7 - 2023/06/17 (土) 23:35:50 - あの たぶん、次だと想像しています 　フリーの状態では、1日以上たつと、タンパクに結合でき無くなるけど(側鎖が壊れる) 　ビオチン本体そのものは残っていて(水溶性のビタミンBのメンバーですから) 　アビジンは結合してしまう。

(無題) 削除/引用 No.11535-6 - 2023/06/17 (土) 23:03:18 - sample あの　さん Ab-10 Rapid Biotin Labeling Kitでは未結合のビオチンをゲル濾過などで抜く手順はついていないので、未結合のビオチンが残ってる可能性はたしかにあるかと思いました。ゲル濾過を検討してみます。 また標識用のビオチンは加水分解されやすく、標識に用いた日しか使えないとのことですが、Ab-10 Rapid Biotin Labeling Kitには標識後は4℃で2週間は安定していると書いています。 dection抗体に標識されたビオチンは加水分解されないが、フリーのビオチンは加水分解されるということでしょうか。 qq　さん ビオチン標識された抗体BをSDS-PAGEに流し膜に転写して、ABC-Complexで検出するとのことですが、　メンブレンについているビオチンに対して、直接、HRP標識アビジンを加え、その後発色ということでしょうか。それでしたら、ビオチンはSDSで直接状になり、アビジンと結合しない可能性もあると思いますが、僕のなんらかの勘違いでしょうか。 もしくは抗ビオチン抗体を買って使用した方がよさそうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11535-5 - 2023/06/17 (土) 22:29:07 - あの まず ビオチン標識した後に、結合したビオチンから、未結合のビオチンを ゲル濾過などで抜くことが必須です。 それから、抗体や目的物質が、ウェルにノンスペシフィック(非特異的)な結合を避ける ための次が必要です: 　ブロッキングの検討や、 　バッファーにいれる界面活性剤の検討 これらが不十分なために、書かれたような問題が起きる可能性があります。 なお想定されているような、 　抗体に結合したビオチンが、別の抗体に結合し直す可能性は、無い と思います。この理由は、標識用のビオチンは加水分解されやすいからです。 標識に用いた日しか使えないと思います。

(無題) 削除/引用 No.11535-4 - 2023/06/17 (土) 21:44:49 - sample 原因として、detection抗体Bのアビジンが抗体Bから離れて、coating抗体Aにくっついたことが想定されるかなと思います。 質問は ➀detection抗体Bのアビジンが抗体Bから離れて、coating抗体Aに結合した以外の可能性はありますか。 ➁自作のELISAでアビジンをdetection抗体から解離せずに結合する方法またはキットがあれば、を教えていただきたいです →すみません。途中でビオチンのことをアビジンで書き間違いました。 以下が正しい文章です。 原因として、detection抗体Bのビオチンが抗体Bから離れて、coating抗体Aにくっついたことが想定されるかなと思います。 質問は ➀detection抗体Bのビオチンが抗体Bから離れて、coating抗体Aに結合した以外の可能性はありますか。 ➁自作のELISAでビオチンをdetection抗体から解離せずに結合する方法またはキットがあれば、を教えていただきたいです

(無題) 削除/引用 No.11535-3 - 2023/06/17 (土) 21:28:18 - あの ビオチン標識した抗体から、アビジンが外れることはありえないです。 ビオチン標識した後に、結合したビオチンから、未結合のビオチンを ゲル濾過などで抜いていないと、残留したビオチンがありえますけど。 サンドイッチの系を確立したいなら、抗体Bの方をコートに用いることも検討したり、 サンドイッチではなくて、競合法にすることも検討されたらどうでしょうか。 競合法の場合には、抗ウサギIgG抗体をコートで、ウサギIgGの標識は不要で、測定対象の純品をビオチン標識です。

(無題) 削除/引用 No.11535-2 - 2023/06/17 (土) 20:56:52 - qq 抗体を精製するところで、Gly-HClなどで溶出しているかと思いますが、このキットはアミノ基を持つ低分子化合物があると結合が妨害されて、Gly-Biotinのようなものができてしまいます。（ふつうのことです） できた抗体を少量SDS-PAGEに流し膜に転写して、ABC-Complexでウェスタンすると、うまくビオチン化抗体が出来ていればビオチン化抗体が検出されるはずですよね？ 確認されると良いと思います。 ビオチン化されていなかったとして、対応策としてはゲルろ過や透析で低分子アミンを除去することでしょう。 また、ビオチン化で抗原結合性を失う場合があることは想像に難くなく、そのような可能性も取説に指摘されています。

サンドイッチELISAで抗体のビオチン標識のやり方 削除/引用 No.11535-1 - 2023/06/17 (土) 20:20:31 - sample サンドイッチ法のELISAで新規に作ったrabbitポリクローナル抗体A（coating抗体）とrabbit抗体B（detection抗体）で血液の中の物質を計測する系を作成している所です。抗体Bは同仁化学のAb-10 Rapid Biotin Labeling Kitでにビオチン標識を行い、-4℃で保存しておりました。 実験ではニュートラビジンと反応し、基質TMBで発色行っております。 しかしいざ行ってみるとブランク（血液の代わりでブッファのみ使用）も含め、すべてのサンプルで同じ吸光度になってしまいました。 原因として、detection抗体Bのアビジンが抗体Bから離れて、coating抗体Aにくっついたことが想定されるかなと思います。 質問は ➀detection抗体Bのアビジンが抗体Bから離れて、coating抗体Aに結合した以外の可能性はありますか。 ➁自作のELISAでアビジンをdetection抗体から解離せずに結合する方法またはキットがあれば、を教えていただきたいです

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