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(無題) 削除/引用 No.11530-2 - 2023/06/17 (土) 02:44:42 - おお とくに制限酵素の種類でライゲーションの方法は変えていませんが、、、 インサートを過剰に入れるとTFの効率が下がりますが、ポジティブのクローンの率が上がりますのでわたしはできるときは1：3〜１０ぐらいと１：１００ぐらいの間で振ったりします。インサートが高い比率のほうでコロニー数が減っているけどクローンがあるときはそちらを優先してミニぷれっぷします。 弊害としてはまれにインサートがリピートして入っていることですが、両端が違う酵素であれば３連でないと入らないし、いまのところそういう経験はありません。同じ酵素であっても２連もかなり低確率ですが、インサートの長さが１００とかそれ以下になると増えてくるでしょうから、見分けがつくような確認の仕方が必要かもしれません。

クローニングにおけるライゲーション条件について 削除/引用 No.11530-1 - 2023/06/17 (土) 01:52:14 - Ligation 制限酵素を用いたクローニングを行なっております。 2つの制限酵素を使用しておりますが、うち1つはNde1となっております。皆様の中にNde1を使用したことがある方がいらっしゃいましたら、その際のライゲーション条件はどのようにしていますか。成功例がありましたらご教授ください。 また、ライゲーションするとき、一般的にはベクターとインサートのモル比を1:3程度にすると思いますが、例えば、1:20のように極端にインサートが多い場合も目的のライゲーションが起こらず、インサートダイマーがドミナントに生成してしまうという認識でよろしいでしょうか。

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