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固めのSDS-PAGE トピック削除
No.11528-TOPIC - 2023/06/16 (金) 21:32:21 - SDS-PAGE
当研究室では今まで10%以下のSDS-PAGEしか行ってきませんでしたが、今回初めて15%で行うことになりました。
定電流(15mA)で流していたのですが、下端がゲルの2/3を過ぎた頃から電圧がどんどん高くなり、その後全く進まなくなりました(高電圧、高温になったので終了)
今まではゲルの下まで流し切るようにやってきたのですが、固いゲルの場合は流し切らないものなのでしょうか？
一般的なTris-Glyバッファーです。よろしくお願いします。
　
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No.11528-7 - 2023/06/17 (土) 16:15:18 - あの
参考までに、バイオラッドのゲルは、定電圧200ボルトが推奨です。

遅らせたい時は、少ない値にするけど。

(無題) 削除/引用
No.11528-6 - 2023/06/17 (土) 02:00:07 - おお
普通は定電流だと電圧は下がりそうですが（電気分解が起きて通電しやすくなるので）。ふだんはそういうことないですか？

個人的な経験としてはゲルの濃度で極端な違いは感じていません。

で電圧がそんなに上がる要因はよくわからないのだけど、どれかバッファーに不備があるとか、カソードかアノードがわかどちらかわからないけど水位が下がってゲルとの接触が不安定になっているとか、、、

私は定電圧でやってますけどね。この場合電流は直後に一旦下がって（泡が出るため）、徐々に上がり始める。ミニゲルで１００Vを基準に自分のスケジュールに合わせて下げたり、若干上げたり。

(無題) 削除/引用
No.11528-5 - 2023/06/17 (土) 00:22:52 - BBB
15%も10%も日常的にやってますが、両者で違うと感じることといったら15%のほうが少しばかり泳動時間がながいかなくらいです。てか違いほとんどわからないです。ミニゲルでBPBのラインがしたから5mm~くらいまできたら止めてます。（早く終わらせたいときはもう少し上でも止めてます。メンンブレンのサイズが小さいとウェスタンのとき抗体液の液量少なくて済むし。）
ミニゲルでサブマリン型の泳動槽で、ゲル１枚あたり20mA定電流、室温の条件で10%gel の場合で1~1.5hrsくらい、15%gelで1.5hrs ＋アルファくらいです。


なので、ゲルの作成等で、なにか間違いがあったのではないでしょうか。gel buffer pH8.8と6.8を間違えたとか、ゲル濃度が実際には15%よりも高かったとか。サンプルの塩濃度が許容レベルを超えて高くて、それをほぼ全ウェルに流したとか。
有色マーカーの分離パタンとかBPBの青い線の直線ぽさの加減とかどんな感じですか。

(無題) 削除/引用
No.11528-4 - 2023/06/16 (金) 23:38:28 - 0616
これが原因ではないと思いますが、私は15,16%ぐらいのSDS-PAGEを行なうときは、泳動前線が濃縮ゲルと分離ゲルの境界ぐらいに到達するまでは15mA、到達後は30mAで設定しています。あと、泳動バッファーを使いまわしていると極端に絵移動時間が長くなるので、使い捨てで使用しています。
何か参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用
No.11528-3 - 2023/06/16 (金) 22:53:10 - 774R
ちなみに見たいタンパク質の分子量はいくつでしょうか？

(無題) 削除/引用
No.11528-2 - 2023/06/16 (金) 21:36:00 - qq
失礼ではありますが、上部泳動層のバッファー漏れではないでしょうか？

固めのSDS-PAGE 削除/引用
No.11528-1 - 2023/06/16 (金) 21:32:21 - SDS-PAGE
当研究室では今まで10%以下のSDS-PAGEしか行ってきませんでしたが、今回初めて15%で行うことになりました。
定電流(15mA)で流していたのですが、下端がゲルの2/3を過ぎた頃から電圧がどんどん高くなり、その後全く進まなくなりました(高電圧、高温になったので終了)
今まではゲルの下まで流し切るようにやってきたのですが、固いゲルの場合は流し切らないものなのでしょうか？
一般的なTris-Glyバッファーです。よろしくお願いします。
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