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(無題) 削除/引用 No.11527-7 - 2023/06/17 (土) 22:00:31 - SYBR master >[Re:1] Ligaseさんは書きました : > NEBのQuick Ligation KitのHPを見ると、 このタイプ(促進）のligation kitは各社から販売されていますが、bufferにPEG6000または8000等(最近PEGで無いものもあるみたいですが、未確認です）が入っています。PEGを含む追加物はクラウディング効果でligationの反応を促進し短時間でtransformation(TF)に持ち込める環状産物を得られますが、長時間反応や酵素の失活のために熱変性(65度10min)を加えた場合、できた環状産物が鎖のように繋がる(メカニズムはよく解っていないらしいけど、たぶん　AFMで見たみたい）ため、TF効率の低下だけで無く、取れてきた産物の正しさ(対象産物も入っているけど同時に余計な配列も入っている）も変更されると教わっております(20年以上前、どこか忘れたけどたしかTakaraでは無いメーカーのテクニカルサポート)。 長時間の反応や、酵素失活の熱変性を加えるならPEGの入っていないT4 DNA ligaseの単品も各社から販売されていますので、そちらを使う方が良い結果が得られると思いますよ。 個人的な感想ですが、日本語で対応できるメーカーのテクニカルサポートのレベルは、 NEB≥ニッポッンジーン>日本ジェネティクス≥TOYOBO=Thermo>越えられない壁>Takaraです。これは研究始めた頃からの印象で、他の海外メーカー加えても最下位はTakaraです。

(無題) 削除/引用 No.11527-6 - 2023/06/16 (金) 16:11:20 - おお >[Re:5] かかかさんは書きました : > ＞2時間以上の形質転換により > 正しく挿入されたもの以外の、異常なライゲーションが起こったものが後から増えて、相対的に正しく挿入されたものの割合が減る、ということなのだと思います。 絶対量が減らないと言う見方ならそれだけでは説明不足ですよね。

(無題) 削除/引用 No.11527-5 - 2023/06/16 (金) 15:33:23 - かかか ＞2時間以上の形質転換により は ＞2時間以上のインキュベート の書き間違えなのでしょうね。 正しく挿入されたもの以外の、異常なライゲーションが起こったものが後から増えて、相対的に正しく挿入されたものの割合が減る、ということなのだと思います。

(無題) 削除/引用 No.11527-4 - 2023/06/16 (金) 12:23:30 - おお ＞副産物が形質転換を阻害するということでしょうか？ そう思っています。

(無題) 削除/引用 No.11527-3 - 2023/06/16 (金) 11:12:17 - Ligase おお様 回答ありがとうございます。 > Insert同士の重合、プラスミド同士の重合、Insertとプラスミドが１：１ではなく複数分子ある長いキメラなど副産物もできますからね。 副産物が形質転換を阻害するということでしょうか？ インサートが挿入されて連結し環状化したプラスミドの連結が外れて、副産物ができると言う意味ではないですよね...？

(無題) 削除/引用 No.11527-2 - 2023/06/16 (金) 02:11:47 - おお >最大で75％減少 平均ではないので何とも判断しづらいとこではありますが、 Insert同士の重合、プラスミド同士の重合、Insertとプラスミドが１：１ではなく複数分子ある長いキメラなど副産物もできますからね。

T4 DNA ligaseによるライゲーション 削除/引用 No.11527-1 - 2023/06/16 (金) 01:27:49 - Ligase NEBのQuick Ligation KitのHPを見ると、「2時間以上の形質転換により効率は減少し始め、25℃、オーバーナイトのインキュベートでは最大で75％減少する。」とありますが、これはなぜでしょうか。 ご存じのかたはいらっしゃいますか。

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