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(無題) 削除/引用 No.11517-10 - 2023/06/16 (金) 20:31:38 - ghjk 硫安が溶けたら攪拌する必要はありません。氷中もしくは4度で数時間〜一晩静置しましょう。不要な攪拌はかえって沈殿形成を妨げます。 TCA沈殿などと違い、塩析の場合、沈殿形成はゆっくりであるていど時間かかります。蛋白質濃度が低いと１時間程度では沈殿が十分に形成されないかもしれません。蛋白質濃度が高い場合でも3〜4時間、希薄溶液なら一晩は置いてます。 大丈夫と思いますが30%飽和硫安濃度と30%硫安を間違えてないですね。（使ってるかもしれないですがオズボーンの表が便利です） 硫安沈殿は1~2ml程度の少量の適当なbufferに溶かして、500~1000倍量の同bufferにたいして透析して硫安濃度を下げることで再可溶化することが多いと思います。硫安沈殿物を直接SDS sample bufferで溶かすとかなり多量のアンモニウム塩を試料中に持ち込むので泳動がみだれたり、本来検出されるべき位置にシグナルが検出できなかったりします。

(無題) 削除/引用 No.11517-9 - 2023/06/16 (金) 10:32:01 - よっしー 温度によって飽和度も変わりますよ．

(無題) 削除/引用 No.11517-8 - 2023/06/15 (木) 09:29:07 - qq １）通常、30%硫安とは30%飽和硫安の事を指すので、%濃度であれば、30%ではなく15%（w/v）程度になるけど、そこは了解していますか？ ２）他の方も指摘にあるように、タンパクが濃すぎるとサンプルバッファーのSDS化のキャパシティーを超えてしまい、電気泳動は乱れます。単に、サンプルバッファーで薄めて泳動すると、うまくいったりすることはないでしょうか？ ３）硫安沈殿前のサンプル、30%沈殿、30%上清（さすが硫安を除去する必要があるかもしれない）を泳動しないと、「30%硫アンでは目的のタンパク質は沈澱しないもの」とは結論付けられないでしょう。 ４）室温で実験されているようですが、あなたの取り扱っているタンパク質は室温で分解されないのでしょうか？30%飽和で夾雑物を除去するステップがある場合がありますが、30%飽和の沈殿には強いタンパク分解酵素活性が含まれる（組織に依存するでしょう）と聞いたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.11517-7 - 2023/06/14 (水) 21:35:41 - おお ペレットをそのままサンプルバッファーに溶解してもいいなら、ペレットをアセトンとかエタノールで洗えばどうかな。

(無題) 削除/引用 No.11517-6 - 2023/06/14 (水) 20:55:07 - のなめ ペレットを直接Sample Bufferに溶解はしないですね。 一度、PBSやのちの工程に適したbufferに溶解して、そのうちの1〜10 uLを泳動します。場合によってはさらに希釈したり。 可溶性画分にがっつり検出されるとのことなので、ペレットをSample Bufferでダイレクトに溶解すると濃すぎるのでは...? その辺の塩梅はご本人しかわからないので、ちょうどよい量を模索してみてください。

(無題) 削除/引用 No.11517-5 - 2023/06/14 (水) 19:56:37 - 柳庵 >のなめ様 ありがとうございます。 透析や脱塩の必要がなさそうで安心しました。 のなめ様はたとえば硫安のペレットを直接、100 ulのSDS sample bufferで溶解した場合、何ul SDS-PAGEゲルにアプライされておられますか？仮に、10 ulだとペレット１０％分となり、残存する硫安の影響が出やすいかなと思っています。

(無題) 削除/引用 No.11517-4 - 2023/06/14 (水) 15:46:26 - G25 >文献によると30%硫アンで沈澱するとありました。 これはあなたがいままさに扱っているタンパク質が30%硫安で沈殿するという文献があるということですか？　タンパク質によって沈殿する硫安濃度はことなりますから、違うタンパク質の話ならその条件で沈殿しなくてもおかしくないですけど。単に硫安濃度が不十分だったということで、もっと濃度を上げれば沈殿するというだけのことじゃないですか。 概ね80%くらいまで硫安濃度を上げると、ほぼすべてのタンパク質が沈殿すると言われています。 30%硫安沈殿に目的のタンパク質が全く含まれていないといいうことですから、沈殿したタンパク質を除いた上清に更に硫安を加えていけばいいでしょう。先に沈殿したタンパク質が除去される分、目的のタンパク質が精製され濃縮されるわけです。 沈殿の条件が未知なのであれば、濃度を段階的に上げて、その都度、沈殿したタンパク質を分取していっって、目的のタンパク質が含まれる画分を見つけるといいでしょう。

(無題) 削除/引用 No.11517-3 - 2023/06/14 (水) 15:44:27 - おお PBS に溶解後、必要量をアセトンで沈殿させて、沈殿物をサンプルバッファーに溶解して泳動。 G25などのスピンカラムで即座に脱塩。場合によってはタンパクがあぐるかもしれないが、適切なバッファーで平衡化していれば大抵の場合大丈夫。

(無題) 削除/引用 No.11517-2 - 2023/06/14 (水) 15:31:32 - のなめ 50%飽和の沈殿物を懸濁して泳動してもそこまで乱れたことはないですね。 上清の除去をしっかりすれば大丈夫だと思います。

硫酸アンモニウム沈澱について 削除/引用 No.11517-1 - 2023/06/14 (水) 15:14:04 - 柳庵 いつも勉強させていただいております。 今、大腸菌にあるタグなしタンパク質を発現させ、リゾチームで溶菌し、可溶性画分を硫アン沈澱させました。文献によると30%硫アンで沈澱するとありました。 そこで、乳鉢で微細な粉末にした硫アンを調製し、可溶性画分に30%となるよう、室温でstirringしながら15分くらいかけゆっくり加え、溶かしました。その後1時間さらにstirringしたのち、15000g, 30 min遠心しまして、沈殿物をPBSに溶解させました。 ここで２つ問題がおきました。 1. PBSに溶解したものにSDSサンプルバッファーを加え、SDS-PAGEしたところ、泳動が乱れてしまいました。おそらく硫アンが残っていたものが泳動を妨げたのだと思っています。 2. そこで硫アンをPBSに溶解後、PBSに対して透析を行いました。一晩透析したものをSDS-PAGEにて解析したところ、興味あるバンドが検出させませんでした。 以上のことから、30%硫アンでは目的のタンパク質は沈澱しないものと考えています。 タンパク質自体はIPTGにより可溶性画分にがっつり検出されることを確認しています。 そこで質問させてください。 今後、硫アンの条件検討（濃度や時間）をするにあたり、透析せずになんとかSDS-PAGEを行えるようにしたいと思っています。硫アン後の再溶解時に工夫できるようなことありますでしょうか？ また、硫アンの基本的なことが間違っていたら、ご指摘いただけますと幸甚です。 当方、硫アン沈澱は今回初めて行っております。

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