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(無題) 削除/引用 No.11510-13 - 2023/06/14 (水) 07:54:57 - エレポー お返事を頂きましてありがとうございます。 エレポ条件を弱めに設定できるかどうか再検討してみます。 電圧は50V刻みで検討したのですが、明確な閾値があるようで、50V変えただけで生存率や導入効率が一気に変わったので、さらに小刻みな調整が必要そうです。 細胞死がマシになる電圧と言っても半分以上は死んでおり、この電圧でもパルス後に細胞がほとんど増えなくなりました。 いちおうターゲットベクターにRFP+HygroRを乗せているのでソーティングや薬剤選択を考えてはいますが、なにぶん生存する細胞が少なすぎ＋パルス後になかなか増えないので、結構な細胞数を用意して結構な回数エレポが必要そうです。

(無題) 削除/引用 No.11510-12 - 2023/06/13 (火) 11:46:41 - ossi >[Re:11] あさんは書きました : > 私なら、あまり死なない程度にエレポを弱めて、GFP発現プラスミドとコトラして、GFP+でソーティングして目的のクローンを拾うかなあ 自分もあまり死なない程度にエレポを弱めて、マーカーでソーティングするのがいいと思います。 ノックインが目的なら、ターゲティングベクターにGFPなり薬剤耐性遺伝子を入れた方が拾うクローン数も少なくて済みます。

(無題) 削除/引用 No.11510-11 - 2023/06/13 (火) 02:31:03 - あ 私なら、あまり死なない程度にエレポを弱めて、GFP発現プラスミドとコトラして、GFP+でソーティングして目的のクローンを拾うかなあ

(無題) 削除/引用 No.11510-10 - 2023/06/12 (月) 22:47:39 - エレポー お返事いただきましてありがとうございます。 導入したいベクターは相同組換え用のターゲティングベクターでベクターバックボーンを除いたホモロジーアームと挿入配列＋HSV-TKで6.5キロくらいはあります。 小さめのベクターで導入効率が良くなっても、目的の大きさの核酸が入らないといけないので、大きいベクターで効率検討していました。 ベクターバックボーンを切れるだけ切って小さくして試してみようと思います。 Cas9+sgRNA発現ベクターも一緒に入れようとしていましたが、こちらは合成sgRNA＋Cas9タンパクに置き換え可能です。 プラスミド中に入って来るエンドトキシンは測定していませんでした。 習慣的に細胞にトランスフェクションするプラスミドはカラム通す前にTriton-x114処理はしてますが、ちゃんと除けているかどうかは測ってませんでした。 現状Neon以外のパルサーが手元になく、Amaxaを気軽に借りられるアテもないのでNeonが使えるものなら使いたいと思っています。 siRNAの導入はスクランブル配列に蛍光付けたものを入れてFACSで確認し、また標的遺伝子のノックダウン効率を確認しています。 標的遺伝子のノックダウン用siRNAではqPCR、ウエスタンブロットともに80-90%くらいのノックダウン効果が見られているので、最低でも80%以上の細胞には導入されているものと考えています。 ベクターをエレポで入れた際に99%以上の細胞が死にますが、生き残ったわずかな細胞にはベクターは入っています。 この生き残った僅かな細胞を増やして使おうとも思ったのですが、細胞がほとんど死ぬような条件では生き残りの細胞も瀕死という感じでなかなか増えてくれません。

(無題) 削除/引用 No.11510-9 - 2023/06/12 (月) 14:21:26 - あ siRNAの確認はFACSですか？

(無題) 削除/引用 No.11510-8 - 2023/06/12 (月) 08:32:07 - EETT もし、amaxaがあるなら、amaxaの方が確実ですよ。 純度と言ったのは、エンドトキシンが入っていないかとかそういうことです。 siRNAが入っているかって、どうやって確認するんですか？%までは分からないですよね。

(無題) 削除/引用 No.11510-7 - 2023/06/12 (月) 06:12:47 - おお しかし死ぬって言うのは何でしょうかね。LPSは入ってないのですよね。 一層のことmRNAを合成して、導入するって言うのを試したくなりそうです。 LPSに対して感受性がそこまで高くない細胞もありますから、入っているなら他の細胞で問題ないというのはあまり当てにならなくなります。

(無題) 削除/引用 No.11510-6 - 2023/06/12 (月) 04:57:11 - おお サイズの問題なら、もしかしたらプラスミドの目的の遺伝子の発現ユニットだけどを切り出すか、PCRで増幅して導入すればマシになるかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.11510-5 - 2023/06/12 (月) 02:38:13 - あ siRNAが入ることが確認できているなら、pmaxGFPのようなサイズの小さなGFP発現ベクターで導入発現条件を検討したらどうですか。 プラスミドは大きくなると途端に入らなくなります。小さなベクターで導入の最適化をして、その条件での導入効率が不満足なら発現ベクターを小さくする工夫をしたら良いと思います。 どのくらいの発現効率が必要なのかや導入後の細胞の用途が分かればもっとコメントがもらえるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.11510-4 - 2023/06/11 (日) 21:12:53 - エレポー お返事を頂きありがとうございます。 invitrogenに聞いた際には電圧とパルス時間の最適化を勧められましたが、今回の私のケースでは電圧・パルス時間を減らす方法は導入率低下のため採用できませんでしたので、それ以外の改善策を探しています。 プラスミドの吸光度測定では260/280、260/230は1.7-1.8くらいでした。ゲル電気泳動でエチブロ染色チェックした際はゲノムDNAの混入はほぼ認められませんでした。OCと思われるバンドは出てましたがマイナーだったのでプラスミドの質は問題ないと考えています。 それ以外の方法でのプラスミドの品質チェックは行っていません。 プラスミドは1 g/Lの濃度で注射用水に溶解して保存・使用しています。

(無題) 削除/引用 No.11510-3 - 2023/06/11 (日) 10:44:27 - EETT プラスミドの純度は大丈夫ですか？ 溶かしている溶液は何ですか？ 水が無難で、できれば、プラスミド濃度は濃いめがいいと思っています。

(無題) 削除/引用 No.11510-2 - 2023/06/11 (日) 00:54:50 - あ invitrogenに聞いたほうが良い

エレクトロポレーションについて 削除/引用 No.11510-1 - 2023/06/10 (土) 21:24:18 - エレポー 浮遊性のヒト腫瘍細胞株にエレクトロポレーションでプラスミド・siRNAの導入を試みています。 エレポの機材はNeonを使っています。 siRNA duplexの導入は問題なく条件設定できたのですが、プラスミド（7000-9000bp）で最適な導入条件を見付けられませんでした。 siRNAと同じ条件でプラスミドを導入すると、細胞死が顕著で99%以上の細胞が死にました。 細胞死がマシになるまで電圧とパルス幅を減らしていくと、導入率が著しく低下し1%も入りませんでした。 このような時、細胞死を抑えつつ導入率をできるだけ上げるにはどのようにすればよいか、改善策のアドバイス頂けましたら幸いです。 プラスミドはキアゲンのmidiprepカラムで調製したものを水に溶かして使用しており、複数のプラスミドで同様の細胞死が見られています。 同じプラスミドを接着細胞にリポフェクションした際は導入効率は問題なく、顕著な細胞死は見られません。 また、複数の浮遊細胞株でプラスミド導入時に同様の細胞死が見られています。

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