>[Re:1] akibooooさんは書きました :
> Fujifilmまたは他の試薬会社のホルムアミドを使ってシーケンスされたかたはおられませんでしょうか？
使えます。が、すこし問題があります。
1. 脱イオンホルムアミドを良い状態で保つには、-20度の凍結融解を避ける必要があります。凍結融解を繰り返す(経験として、5回以上）と吸水して、かつ分解が始まります。
参考； http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech3/biotechforum.cgi?mode=view;Code=2445
2.状態の悪いホルムアミドでは、波形が乱れ最悪データが取れなく為ります。
3.それ故、200mLもあると小分けする必要がありますが、この時エッペンドルフチューブのようなスナップ式のチューブは機密性が低いので不適で(余り開け閉めのしない-20冷凍庫を持っていた場合は別）、スクリューキャップ式(外ねじ）でかつ密封性が高いものが望ましいです(セラムチューブやクライオチューブ等, O-lingは無くても良い）。コニカルチューブ(50 mLはまだしも15 mLは絶対駄目)は経験的に不向きです（余り密閉性は高くないので）。
4.ガラス製は厚さにもよりますが薄いと凍結で割れる可能性が有るので却下です。プラスチック(PP, PE,PC等）なら大体どれでも使えます。
5.で此所で問題があるといったのは、これらのチューブは値段が高いことです。セラムチューブで大体300-500本で2-3.5万位でしょうか。クライオチューブはもう少し安いかもしれません。また、25-50 mLのボトルは、最低100本からのセットで、大体4万弱位です。
6.となると、ホルムアミドの1日当たりの使用量を鑑みて、分注量を決定する必要があります。1wellに分注する量次第(当時は10uL/wellで、1mL/plateで計算していた）で、その値は変わってきます。
7.以前のスレッドで4,000件のシークエンスと書かれていましたので、その程度の量なら、シークエンス成功率70%(一般的なplasmidのショットガンシークエンスの成功率）で考えると6,000件程度のシークエンスで、96wellなら70枚くらい、必要ホルムアミドが1×70=70 mLなので、チューブ買ってまで小分けするくらいなら、HiDi買って使った方が楽ですし、安上がりになるかもしれません。 |
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