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(無題) 削除/引用 No.115-6 - 2013/04/10 (水) 00:27:14 - ねずみ まず、 >解決策など思い当たることがあれば、 撒くfeederが多すぎます。6 wellプレート1 well当たりであれば、お示しの1/4程度で 十分です。もっと少なくてもいいかもしれません。端から剥がれてくるのはfeederが 多すぎる時の典型的な症状です。 私も初心者の頃に同じようなことを経験しました。 > なぜこのようなことが起きてしまうのか、 ES細胞はfeederの上にのっていると勘違いされている方も多い（特に細胞培養に慣れて いない人は）のですが、ES細胞はfeederを押しのけるような感じで増殖していきます。 実際にはfeederであるMEF自体がかなり動き回っているので（time-lapseで観察すると よくわかります）押しのけているという表現は正しくないかもしれませんが。 そのようにしてES細胞が増殖するとfeederの行き場所が減っていきます。MEFはcontact inhibitionがかかるのでconfluentになると増殖が止まりますが、ES細胞はそうではない のでおかまいなしに増えます。そうするとfeederがどんどん押しやられていくので、 feederの密度が高いと端に追いやられたfeederが剥がれ始めます。

ES細胞の培養していて疑問点 削除/引用 No.115-5 - 2013/04/09 (火) 20:01:25 - ES初心者 ES細胞の培養していて疑問点がいくつかあり質問させて頂きます。 1 ES細胞をストックから起こしてきて、継代を何回繰り返してからバイオロジカルな実験に使えるか？ mediumがもったいないので、起こしてきた細胞が増えたら、そのままDNA回収してもよいか疑問に思いました。 2　継代の際にfeeder細胞＋ES細胞を次のfeederつきdishに植え継いでいけば、毎回feeder細胞の濃度が上がり続けないですか？ 3　ES細胞のDNAを抽出したいときに、ES+feederをdishに入れて、1時間程度待って、上清をとることでES細胞をselectしています。 この際、ある程度feederも混じると思うのですが、FACSでsortingしたり、他の方法で純度を上げる必要がありますか？

(無題) 削除/引用 No.115-4 - 2012/02/08 (水) 12:56:21 - 福岡ガールズ うちではマウスの胎仔から直接MEFを作ってます。 パッセージ回数も非常に若いので、安心して使えます。 以前に市販のMEFを購入して使用してみたこともありますが、 パッセージ回数が進んでるし、ESのコロニーの形態もきれいじゃ なかったので、本当にMEFの機能をはたしているのか怪しかったです。 それ以来、市販のものは使わないようにしました。

(無題) 削除/引用 No.115-3 - 2012/02/08 (水) 09:30:55 - LIF 福岡ガールズさん お返事ありがとうございます。 dishはコーティング無しでやっていました。 MEFが剥がれるのが気になってから、0.1%ゼラチンでコーティングして培養してみましたが、やはり剥がれてくることがあります。 ES細胞を継代した後、コロニーがまだ小さいうちに剥がれたりMEFのシートに穴があいてしまいます。 やはりMEFの状態が悪いのでしょうか。。

(無題) 削除/引用 No.115-2 - 2012/02/06 (月) 10:40:29 - 福岡ガールズ dishのコーティングは何をしよると？

マウスES細胞のfeederについて 削除/引用 No.115-1 - 2012/02/03 (金) 18:08:30 - LIF いつも閲覧させていただき、実験の良い刺激になっております。 マウスES細胞の培養について質問させてください。 C57BL/6の13.5日目の胎仔からMEFを作成し、4継代目のものを4000rad照射し、feederとして使用しています。6 wellプレートの1wellあたり、1×10e6のMEFを使用しています。この細胞上でマウスES細胞を維持培養しているのですが、wellの周辺からfeederごと細胞が剥がれてしまうことがあり困っています。 MEFの照射が十分でなく、増殖してしまうためにover confluentになり剥がれてしまう可能性を考えましたが、MEFのみで培養していても剥がれることはなく、1週間以上培養できました。また、ES細胞用の培地でMEFを培養しても剥がれることはありませんでした。 　 なぜこのようなことが起きてしまうのか、また解決策など思い当たることがあれば、不慣れな自分にお聞かせいただけませんでしょうか。 よろしくお願いいたします。

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