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(無題) 削除/引用 No.11499-4 - 2023/06/06 (火) 22:26:39 - SYBR master 大体のことはおおさんやG25さんが書いているとおりです。たぶん、貴方のメンターは、貴方の知識や思考を試しているものと思われます(僕は面倒なのでしません(学生によるけど））。 >[Re:2] G25さんは書きました : > PBSで洗浄するのは環境の変化をもたらしますので、RNA発現のプロファイルが影響を受ける可能性はあります。求められる実験の精度によっては配慮が必要かもしれません。 今私は微生物(原核）を主に対象として実験していますが、有る微生物は遠心分離(当然4度）で集菌しただけで、RNAが壊れました(電気泳動で確認済み,2つのrRNAが見えない）。どうも原核微生物ではこのような例は普通にあるみたいで、現在その菌については培養後すぐに前処理(ほぼRNAが壊れないように培養液ごと固定。組成は一般的に動物や植物で使われるRNAlaterとは全く異なります）してからRNAを抽出しています。 このように、集菌だけでRNAが壊れる（プロファイルはぐっちゃぐちゃ）なら、PBSによるwashやトリプシンで細胞はがして細胞を遠心して集める、と言う作業が「余計なシグナルが細胞に入る」ため、G25さんが書いた「RNA発現のプロファイルが影響を受ける可能性」は容易に想像できませんか？

(無題) 削除/引用 No.11499-3 - 2023/06/06 (火) 16:58:20 - おお 動物細胞のRNA 抽出用バッファーはほとんどの場合強力な変性剤であるグアニジンイソチオシアネートがはいっていますので、培地を捨ててPBSなどで洗わず直接抽出用バッファーを加えればいいです。また、PBSに混入するRnaseが問題になるなら、細胞内のRnaseも問題になるはずですが、そんな事はありません。 それでもPBSのRnaseを除きたいなら、PVDFを使った0.2umのボトルトップフィルターでタンパク質を吸着と同時に滅菌するといいです(あまり意味ないけど)。

(無題) 削除/引用 No.11499-2 - 2023/06/06 (火) 16:52:48 - G25 そもそも培養細胞体がRNase freeではなく、一番のRNaseソースは培地や細胞自身です。その時点で洗浄液などのRNase混入を気にしても意味がない。 あなたはこれからRNaseたっぷりの細胞からRNAを単離しようとしていて、それでもRNAをintactで保てる試薬や方法を採用しているはずです。 言われたことに盲目的にしたがうのではなく、ちゃんと理性的、論理的、合理的に考えたら良いと思います。 ただ、 PBSで洗浄するのは環境の変化をもたらしますので、RNA発現のプロファイルが影響を受ける可能性はあります。求められる実験の精度によっては配慮が必要かもしれません。

培養細胞からのRNA抽出まえにPBSで洗う件 削除/引用 No.11499-1 - 2023/06/06 (火) 15:39:01 - BBB 培養細胞からRNAをとりたいです。培地を除去した後　細胞をPBSで洗うべきでしょうか。それとも洗わずにLysis buffer入れてもOKでしょうか。ていうのがNAse Free PBSを持ってなくて、細胞を洗わなくていいならば買わずに済むので（ていうか探した限りでは売ってないのです）。それとオートクレーブしたPBSは完全にはRNase freeじゃないけどいいのとかこのまえいわれたので。

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