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(無題) 削除/引用 No.11497-7 - 2023/06/08 (木) 11:08:48 - Ca お三方様 ご返信ありがとうございます。 G25様 確かに頭の中で混同しておりました。訂正ありがとうございます。 また、Tm値が70℃であることから、2 step PCRで行おうと考えておりました。 Tm値が70℃にになる理由はプライマー鎖長が長いためで、特にGC-richの配列ではありません。 プライマー鎖長を長くした理由の1つとして、できるだけ早くPCRを終了させる検討も含まれているからです。温度変化の幅をを95-70℃付近に通常よりも狭くすることで少しでも早く終わらせることはできないかと考えております。 使用するキットはあえて伏せさせていただきます。申し訳ございません。

(無題) 削除/引用 No.11497-6 - 2023/06/08 (木) 03:10:20 - おお GCが多いところに設定しないといけないということですかねぇ。。。 21merでGCが１２個ぐらいでも７０度近くになりますね。GかC一つ除くだけでもかなりTm下がるので末端の１、２塩基削るっていうのも手かもしれない。１９merならそんな短いという感覚はないし。real timePCRではどうかわからないけど２２、３merで７０近くになってしまうプライマーはたまに使うけど普通のPCRではそんなに困ることもないけどね。 それとも３０mer近くの長いプライマーを使わざる負えないのだろうか。

(無題) 削除/引用 No.11497-5 - 2023/06/07 (水) 21:51:29 - あの 念のため、どのリアルタイムPCRキットを使うのか明記したら？

(無題) 削除/引用 No.11497-4 - 2023/06/07 (水) 15:54:46 - G25 >Tm値を上げることで特異性は上昇するが感度は低下するという認識でいます。 「Tm値」を上げる話ではなくて、同じプライマーで「アニール温度」を上げたときの影響の話と混同しているのでは？　それなら特異性と増幅効率のトレードオフが起こり得ます。 Tmを高くしたって、それに最適化した温度条件を設定するならば、感度、増幅効率が低下するとは言えない。 Tmが高くなる理由が著しくGC-richだからというなら、二次構造によるPCR効率の低下や非特異的プライミングのリスクがあがるというデメリットが考えられます。 塩基組成に著しい偏りがなく鎖長が長いためTmが高くなるという場合、 理論的には鎖長が長くなるほどアニールのカイネティクス（速度）は低下するので、アニール温度の保持時間が同じだと効率が低下するかもしれません（プライマー程度の鎖長ではカイネティクスはそれほど変わらないかもしれないけど）。Tm 70℃付近のプライマーだと変性温度と伸長温度を往復する2 step PCRがスタンダードですね。伸長ステップがアニールステップを兼ねるので、アニール時間は気にしなくてよさそうではあります。

(無題) 削除/引用 No.11497-3 - 2023/06/07 (水) 13:06:57 - Ca SYBR master様 ご返信ありがとうございます。 特異的に増えるのであれば、Tm値は無視して良いパラメーターだということ、承知しました。 プライマー濃度濃度に関するご助言もありがとうございます。 Tmはオリゴの濃度の低下依存的に下がって特異度が増すということは初めて知りました。 教えていただいたことを参考に一度検討してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.11497-2 - 2023/06/06 (火) 22:45:04 - SYBR master >[Re:1] Caさんは書きました : > 一般的には60℃付近だと思うのですが、Tm値を70℃にすることによるデメリットは何が考えられますでしょうか。 特異的に増えるのであれば、普通のPCRでもqPCRでも、Tm値は無視して良いパラメーターだと経験的には思います。 > Tm値を上げることで特異性は上昇するが感度は低下するという認識でいます。 オリゴのTmが70℃だと、PCRサイクルのannealing温度が60℃付近だと、非特異的にprimingし易い状況＝特異度が下がります。その場合、primer濃度を現状より、1/10,　1/100....等下げて使用した場合、Tmはオリゴの濃度の低下依存的に下がりますので、特異度が増します。経験的に、オリゴ濃度の変更だけで20mersのprimerで、3'末端1塩基の違いを区別できるPCRの設定が行えます。 ここら辺の細かいことは、IDT社のOligo analyzer(登録は必要）で試すと良いかもしれません。 https://sg.idtdna.com/calc/analyzer たしか、このtoolに関して(パラメーター内容）は論文が2つくらいNARに出て居たはずです。

プライマーにおけるTm値について 削除/引用 No.11497-1 - 2023/06/06 (火) 15:29:42 - Ca いつも勉強させていただいております。 プライマーのTm値についてお聞きしたくトピックを立てました。 これから、リアルタイムPCRを行う予定なのですが、使用するプライマーのTm値を70℃付近で作成したいと考えています。こうしないといけない諸事情があります。 一般的には60℃付近だと思うのですが、Tm値を70℃にすることによるデメリットは何が考えられますでしょうか。 Tm値を上げることで特異性は上昇するが感度は低下するという認識でいます。 お忙しいところ恐縮ですが、ご回答いただければ幸いです。

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