＞GSTーアクセプトを用いた場合吸着力が非常に強いため、
よくわからないですね。リガンドはグルタチオン、マトリックスは4%アガロースごく普通の他社でも作ってそうなもので、特別強いわけでもなさそうだし、言っている吸着力っていうのがリガンドへの吸着力というなら、Thrombinで切断した１２ｋDaがリガンドについているというのは変だし、マトリックスの4%アガロースはそんなに吸着力があるものではなく（マトリクスにつかないようにふつうそういうものをつかう）それを吸着力が非常に強いというのは、はて、とおもう。ただしそれでも吸着してしまう事はなくはないので以下にそれを含めて書いておきます。
まず、ちゃんとビーズにそのGST-目的のタンパクはついていますか？吸着してなかったらビーズからは溶出できません（ちゃんと確認作業しているならお許しください）。
GST-目的のタンパクは、グルタチオンで溶出できますか？できないならアガロース担体に非特異的に吸着してしまっている可能性があります。
Thrombin で切断して溶出していると思われますが、ビーズから変性剤などで強制的に溶出したときに１２ｋDaが検出されますか？
目的のタンパクの配列にThrombin認識部位がないですか？
実際まあまあの頻度であるのは、GSTを切断したとたんに可溶性が低下してビーズに非特異に吸着してしまうという事態です。吸着を防ぐためのブロッキングや溶出できるようなバッファーの工夫も対処する手段としてあります（まあいろいろやってダメだったということも結構あります）。
もしブロッキングするならBSAまたはPVPなどのポリマーですかねぇ。どれだけの事例でそれがうまくいっているのかわかりませんが。 |
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