BioTechnicalフォーラム [ドットブロットのプロトコル]

ドットブロットのプロトコル

No.11461-TOPIC - 2023/05/23 (火) 15:07:48 - ちなぴ

いつもお世話になっております。

ウエスタンブロットにて目的位置にバンドが出ないため、サンプルと抗体を疑っております。
(目的バンドとは全く別位置に非特異バンドは出ております。)
そのため、ドットブロットを実施してみたいのですが、経験がなく、プロトコルを教えていただけないでしょうか。。。

メンブレンはPVDFしかなく、検出もHRPのみしかできないです。

よろしくお願いいたします。。。
　

- このトピックにメッセージを投稿する -

全8件 ( 1 ～ 8 )　前 | 次　1/ 1. /1

(無題)

削除/引用

No.11461-8 - 2023/05/24 (水) 09:04:50 - TS

シンプルに使えない抗体は山ほど販売されていると思います。
WBを日常的に行っているラボであって、特段特殊なタンパク質でないのであれば、抗体がダメなのでは？
細胞に強制発現させたようなポジコンを作って検証するのは？

ドットブロットは方法にもよるでしょうけど、WBでシングルバンドが出ているときに使えるという印象です。じゃないと、ゲル分離がないので何を見ているかわからなくなる。もし抗体がNative構造を認識するもので、ドットブロットでは変性させないサンプルを使うというのであれば、この限りではないかも。ただ一般的にWBがダメだから、ドットブロット、という流れはあまりないような。アプライできるタンパク量も少ないですしね。

(無題)

削除/引用

No.11461-7 - 2023/05/23 (火) 23:56:31 - おお

それは本当に目的のタンパクのバンドでは無いのですか？

(無題)

削除/引用

No.11461-6 - 2023/05/23 (火) 21:02:57 - 2ME

Milliporeのプロトコルがあるので参考にしてください。

https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/313/407/tp001en-ms.pdf

5 PROTOCOLS
1 Protein Transfer Protocols
1.3 Dot Blotting/Slot Blotting: Vacuum Filtration Method 39
1.4 Spot Blotting: Manual Spotting Method 40

簡単に言えば、前処理したPVDF膜にサンプルをスポットとしてバキュームするか風乾する。それからいつもの抗原抗体反応と発色。詳しくはPDFをご確認ください。

他のコメントにあるように、ドットブロットは、ポジコンとネガコンを置かないと、何を見ているのかわからなくなります。ポジコンは純粋抗原の希釈系列をブロットするとよいと思います。

未経験ということは、その抗原とその抗体の組合わせによるドットブロットの実験系としては確立していないということでしょうから、試行錯誤の連続になると思いますよ。嫌になったらやめてよいですよ。ご武運を祈ります。

主です

削除/引用

No.11461-5 - 2023/05/23 (火) 18:35:55 - ちなぴ

ご回答いただきましてありがとうございます。

非特異バンドが出てるのでドットブロットでもそのシグナルが出るという可能性を理解しておりませんでした。。。

ウエスタンにて適正位置にバンドを出すために、別の方法も検討してみます。
ありがとうございます。

(無題)

削除/引用

No.11461-4 - 2023/05/23 (火) 18:17:49 - cagy

問題の解決のためにドットブロットにどのようなことを期待されているのですか。そのあたりのことがよくわからないので。

(無題)

削除/引用

No.11461-3 - 2023/05/23 (火) 17:01:20 - 774R

WBで目的外の位置にバンドが出るなら、ドットブロットでもそのシグナルが出ることが予想され、目的のシグナルを取得できたかの判定は更に困難になります。
WBで辻褄が合わないのでドットブロットで誤魔化そうとしてるわけではないですよね(;^_^A