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皆様ありがとうございます。 削除/引用 No.1146-12 - 2012/11/14 (水) 10:10:12 - 110 　たくさんのご回答、本当にありがとうございます。 　No1146-9さんが仰られているように、使用したプラスミド量が少なかったかもしれません（300ngほどしか使用していない）また、No1146-7さんが仰られているように、EtBr染色時間を短めにしてみます。 　次は、No1146-11さんが仰られているように、プラスミドには存在せず、インサートのみに存在する制限酵素で切って確認してみたいと思います。 　多くのアドバイスありがとうございました。非常に助かりました！

(無題) 削除/引用 No.1146-11 - 2012/11/14 (水) 09:23:44 - qq インサートの中で一つ（更にベクター側の離れたところで一つ切れるとなおよい）切れる酵素で切ってみたらどうよ？そんな酵素は無かったですか？

(無題) 削除/引用 No.1146-10 - 2012/11/13 (火) 20:46:56 - Harmonia ＞2種類の制限酵素でdouble digestion 同じ酵素で切断可能なら、それぞれ一つで切ったのとダブルとを準備し、 泳動は片方、ダブル、もう片方、の順にすれば？ 前提として、RNase処理が十分されていてRNAが見えないこと。

(無題) 削除/引用 No.1146-9 - 2012/11/13 (火) 16:28:09 - おお DNA量ははかってのせているでしょうか?完全にRNAやそのフラグメントが抜けた状態で正しくはかれている条件付で、0.7kのフラグメントが検出できるためにはどの程度のプラスミド量が必要か計算できますよね。ちなみに理想的な状態でエチブロで検出できるDNA量は数ng(ひとケタ)です。余裕をもって50ngの0.7kが得られるには1マイクログラム弱のプラスミドが必要ですよね。

(無題) 削除/引用 No.1146-8 - 2012/11/13 (火) 15:51:21 - AP 濃度1%以下のアガロースなら、30分以下で染色飽和しますし、飽和に達しなくても10分も染めたら見えます。逆に長すぎると拡散によってぼけます。 今回の問題がそのせいかどうかは別ですが。 ゲル濃度、バッファー系、それと制限酵素消化〜泳動までに特筆すべき点（特殊なバッファーを使っているとか、前処理に何かしているとか）が何かあったら、情報を。

(無題) 削除/引用 No.1146-7 - 2012/11/13 (火) 15:30:13 - おお >[Re:4] 110さんは書きました : > �A 泳動から観察までは速やかに行なっております。泳動30分+染色60分後 染色60分後は長すぎます。5分もあれば十分だと思います。

(無題) 削除/引用 No.1146-6 - 2012/11/13 (火) 15:28:19 - おお ちなみに培養時間とインサートのバンドの光具合は普通は関係ありません。ただし、シングルクローンでも厳密にシングルクローンといえるかどうかという点で、インサートの入ってないクローンがドミナントになってきたというケースは否定できない場合もあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1146-5 - 2012/11/13 (火) 15:24:07 - おお バンドのひかり具合は均一に染まっていても0.7kのバンドは10kの10分の1以下です。エイどうの条件や染め具合などいろいろな原因で低分子がわはぼやけたようなバンドになることはまあまああります。インサートは入っているようなきがしますが、気になるようであれば、インサートにだけある制限酵素とか、インサート内とベクターに一つずつ(ベクターに2つあっても良いですがあまりたくさんあるとややこしいので)認識配列があるような、よく切れる酵素で切ってみて再確認する手もあるとおもいます。うまく選べば0.7とかよりもっと長いフラグメントで検出がもう少し楽になるかもしれません(ただ、0.7ならそんなに短くて困る長さでもないですけど)。 仰っているように培養時間は長すぎると思います。いんタクトなプラスミドが取れているかどうか気になります。

補足 削除/引用 No.1146-4 - 2012/11/13 (火) 15:14:14 - 110 ご回答ありがとうございます。情報を補足しておきます。 �@ ゲルにエチジウムブロマイドは混ぜておりません。泳動後に染色をしています。 �A 泳動から観察までは速やかに行なっております。泳動30分+染色60分後、すぐに観察しております。 よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.1146-3 - 2012/11/13 (火) 14:18:47 - AP ゲルにEtBrを混ぜる方法だと、EtBrが陰極側に流れるので、低分子量側のDNAの染色が極端に薄くなってもおかしくない。 泳動から観察まで、速やかに行っているかどうか。長く放置されることがあると、特に低分子量の核酸は拡散してぼけやすい。

うーん 削除/引用 No.1146-2 - 2012/11/13 (火) 14:05:07 - Cm

制限酵素のプラスミドチェック 削除/引用 No.1146-1 - 2012/11/13 (火) 13:59:05 - 110 　いつもお世話になっております。プラスミドを電気泳動した際のバンドの濃さ（薄さ）のことについて質問があります。 　10kbpのプラスミドに0.7kbpのインサートを2種類の制限酵素でdouble digestion→ライゲーション→形質転換→（目的のプラスミドを持ったコロニーであるかどうか確かめる）→plasmid抽出の方法で抽出しました。抽出したプラスミドが目的のものであるかどうか調べるため、再度double digestionを行い（インサートが入っているならば、10kbpと0.7kbpのバンドが検出される）、電気泳動の後、エチジウムブロマイド染色をして目標の断片があるかどうか調べました。 　その結果なのですが、10kbpの方は濃いキレイなバンドが検出できたのですが、0.7kbp（インサート部位）の方はものすごく薄いぼやけたバンドが検出されました（2バンドとも、位置は合っています。）理由はよくわかりませんが、プラスミドを取る際に、菌（大腸菌）を長く培養させすぎた事が原因かもしれません（50時間ほど培養させた培養液からプラスミドを抽出した） 　この場合、プラスミドはインサートが導入されたと考えてよいのでしょうか？それとも、導入はされていないと考えた方がよいのでしょうか？皆様の意見をお聞かせ願えますか？？

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