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(無題) 削除/引用 No.11457-5 - 2023/05/29 (月) 20:36:45 - 酵母 皆様、回答ありがとうございます。 例えば、SDS-PAGEの結果、シグナルが機能しておらず細胞内に留まっているような場合は、どのような対処を行えば良いでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11457-4 - 2023/05/23 (火) 16:34:00 - pp 私も培養時間を長くするのは試す価値があると思います。私の経験した例で、参照していたプロトコルでは４日目まで発現を検討するとされていたところ発現が見られず、思い立って７日目まで見てみると５日目からバンドが現れはじめ７日目がピークだったことがありました。 また別の点ですが、シグナルペプチドが機能せず目的タンパク質が細胞内に蓄積されていたことがありましたので、最初の段階では細胞内の発現もモニターすることをおすすめしたいです。

(無題) 削除/引用 No.11457-3 - 2023/05/23 (火) 11:58:38 - 培養時間 過去に20時間培養で問題なかったらすみませんが。 12か24時間ごとにメタノール添加し、もう少し長い時間（72-120時間）培養を行ってはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.11457-2 - 2023/05/23 (火) 06:35:21 - おお http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/pich_man.pdf 一応参考資料として、いろいろなたんぱくの収量とか示されているようですけど、分泌たんぱくで一番低いのは、0.004ｇ/Lということです。４ｎｇ/uｌなのでこれだとちょっとCBB染色では見れないですね。抗体は使えませんか（WBする）？ あと精製についてはどのようにする予定ですか？何らかのTagでエンリッチメントできるならそこまでやってからでもいいかもしれません。ほかには硫安沈殿とか（適切な濃度がすでに分かっているなら）。イオン交換にとにかくつけて、高塩濃度で一気に結合しているものを遊離させてとにかくタンパクを濃縮するというのでもいいし。

酵母を用いた異種タンパク質の分泌発現 削除/引用 No.11457-1 - 2023/05/21 (日) 22:49:34 - 酵母 こんにちは。 最近、Pichia酵母を用いた異種タンパク質の分泌発現系に取り組んでいます。得られた形質転換体のタンパク質発現を評価するために小スケールで培養し、SDS-PAGEを行ないましたが、目的タンパク質を思われるバンドは見られませんでした。考えられる原因について、ご教授いただけますと幸いです。実験の流れは以下に記します。 (1) 形質転換後、RDB寒天培地 (His無し) で培養し、形質転換体を得た。ベクターはStu1でリニアにしている。 (2) BMGY培地で約24時間培養。 (3) 遠心で菌体を回収し、BMMY培地に再懸濁し、約20時間培養。 (4) 上清をSDS-PAGE

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