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GEF活性 トピック削除
No.11451-TOPIC - 2023/05/18 (木) 21:09:25 - aat
GST-CRIBをPull　doｗnに用いてGEF活性を見ています。
標的遺伝子とRac1をTransfectionした際に、
InputではRac1が常に認められますが、ＩＰでは回によって見えない時があります。
プロトコルは同じものを使用しています。
原因に検討がつかず、困っています。
ご存じの方がいましたら、ご意見を聞かせていただきたいです。
よろしくお願いします。
　
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No.11451-8 - 2023/05/21 (日) 13:58:58 - att
>[Re:7] Skepticsさんは書きました :
> > Myc-Rac1をCRIBで、プルダウンしたあとウェスタンブラットでMyc抗体を用いて検出しています。
>
> それはIP（immunoprecipitation）とは言いません。
>
> 本題に関しては、単にGTP-bound formが検出限界より少ないだけではないのですか？
>
>
ご指摘ありがとうございます。
単に検出限界を下回った可能性は否定できないです。
ありがとうございます。

>[Re:6] おおさんは書きました :
> ですから、RAC1-GDPにCRIBはつかないですよね。実験操作中とかにどうやってRAC1-GTPを維持しているのか、できるのかという話を投げかけているのです。

Rac1-GTPを維持しているのか、できるのかについては盲点でした。
GEF活性が働く条件は考えていたのですが、働いていても維持されていなければ意味がないですね。
ご意見ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.11451-7 - 2023/05/20 (土) 09:33:38 - Skeptics
> Myc-Rac1をCRIBで、プルダウンしたあとウェスタンブラットでMyc抗体を用いて検出しています。

それはIP（immunoprecipitation）とは言いません。

本題に関しては、単にGTP-bound formが検出限界より少ないだけではないのですか？

(無題) 削除/引用
No.11451-6 - 2023/05/20 (土) 02:05:45 - おお
ですから、RAC1-GDPにCRIBはつかないですよね。実験操作中とかにどうやってRAC1-GTPを維持しているのか、できるのかという話を投げかけているのです。

(無題) 削除/引用
No.11451-5 - 2023/05/19 (金) 15:36:53 - att
>[Re:4] おおさんは書きました :
> 抗体を使ったimmunoprecipitation なんですか？CRIBでプルダルンでは無いのですか。それとも一連の操作で両方するのですか？
> 参考にしたプロトコール(文献)は開示できますか？


Myc-Rac1をCRIBで、プルダウンしたあとウェスタンブラットでMyc抗体を用いて検出しています。
プロトコルはライサートをMgの入ったGSH-FISH bufferを用いてプルダウン後、ウェスタンって感じです。

(無題) 削除/引用
No.11451-4 - 2023/05/19 (金) 13:53:18 - おお
抗体を使ったimmunoprecipitation なんですか？CRIBでプルダルンでは無いのですか。それとも一連の操作で両方するのですか？
参考にしたプロトコール(文献)は開示できますか？

(無題) 削除/引用
No.11451-3 - 2023/05/19 (金) 13:46:29 - att
>[Re:2] おおさんは書きました :
> Rac1が毎回一定量（比）GTPを結合しているかはどのようにクリアーしていますでしょうか。

返信ありがとうございます。
ウェスタンブロットで得られたバンドのシグナル強度をIP/Inputで計算しています。
回によってIPのバンドが薄く見えるとかではなく、
IPだけ全サンプルでバンドが全く見えないので不思議に思っています。

(無題) 削除/引用
No.11451-2 - 2023/05/19 (金) 04:36:06 - おお
Rac1が毎回一定量（比）GTPを結合しているかはどのようにクリアーしていますでしょうか。

GEF活性 削除/引用
No.11451-1 - 2023/05/18 (木) 21:09:25 - aat
GST-CRIBをPull　doｗnに用いてGEF活性を見ています。
標的遺伝子とRac1をTransfectionした際に、
InputではRac1が常に認められますが、ＩＰでは回によって見えない時があります。
プロトコルは同じものを使用しています。
原因に検討がつかず、困っています。
ご存じの方がいましたら、ご意見を聞かせていただきたいです。
よろしくお願いします。
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