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(無題) 削除/引用 No.11444-5 - 2023/05/18 (木) 15:14:27 - SYBR master 昔々、研究対象として上がってきたタンパク質が、組織由来のwestern blotではサイズが予想値の2倍になって出てきましたが、培養細胞でover expressionするとサイズが予想値で出たことがあります。たぶん、タンパク質の構造予測の中に"dimerization domain"があったので、それと関連しているのかもしれませんが、その時の論文のメインテーマともかけ離れるし、何故それが起きるのかがイマイチ説明できるほど知識(タンパク質の構造）も無かったので、論文の中では言及せず、データがまるっと未公開の物があります。 該当タンパク質がそれに当たるかどうか判りませんが、"SDS resistance"でGoogle schlor検索した場合、1590件ほどヒットするので、SDS耐性タンパク質は有名ではないにせよ、知っている人は知っているタンパク質なのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.11444-4 - 2023/05/17 (水) 08:51:01 - たろー 他にも書かれている方がいらっしゃいますが、糖鎖などの修飾がある可能性はないでしょうか？ あとリジンなどのプラスチャージが多いタンパク質は予想されるバンドの位置よりかなり上に出ることがあります(2倍はちょっと多すぎる気がしますが)。

(無題) 削除/引用 No.11444-3 - 2023/05/17 (水) 03:33:37 - おお その７０ｋDaという見積もりはアミノ酸配列から推測（計算）したものでしょうか？それなら修飾によってサイズが大きくなる可能性はありませんか？ 因みにそのタンパク質の抗体が販売されているなら、そのカタログにCell lysateをつかったWBを示してませんか？それも同様に１４０に出るようならそういうものなんでしょう。抗体によってはメインのバンドよりノンスぺが目立つのでそれがリアルなバンドと思ってしまう事もありますし。 ダイマーができるとしてまったくフリー（７０）が検出できないのはちょっと不思議なのでその辺もちょっと考えたほうがいいかもしれません。アミノ酸の偏りはないですか？HistoneやHMGはサイズが２倍ぐらいに見えることがあります（もともとの分子量は小さいので影響をうけやすいというのはありますが）。

(無題) 削除/引用 No.11444-2 - 2023/05/16 (火) 22:44:17 - 2ME この掲示板でも何度か話題になっていますが、サンプルバッファーでボイルしたせいで、SDS-PAGEで解離しない程にタンパク質が凝集する事例が知られています。このような場合には、サンプルバッファーでボイルせずに、室温や4℃など、マイルドな条件で処理することが推奨されます。 一方、生理的な現象に限定すれば（アーティファクトや実験ミスを考えないとして）、たとえば、リジン残基とグルタミン酸残基によるイソペプチド結合による分子間架橋や、あるいは糖鎖付加など共有結合による高分子化が考えられます。

還元状態でも多量体形成維持は可能でしょうか？ 削除/引用 No.11444-1 - 2023/05/16 (火) 19:49:42 - 還元状態でのダイマー形成？ 質問させてください。 当方ある細胞質タンパク質（予想分子量70 kDa）を研究しています。 内在性のものを認識できる抗体でウエスタンを行うと140 kDaにバンドが現れ、siRNAでノックダウンをすると綺麗に140 kDaバンドが消失するので、特異的な抗体だと思っています。 なぜ70 kDaのものが140 kDaとして検出されるのか不勉強なため理解できません。 サンプルの処理は通常のcell lysis buffer (1% Triton-X100-based)なもので可溶化し、遠心したものに、Laemmuli SDS sample bufferを加えて3分ボイルをしています。膜タンパク質ではないので膜貫通ドメインは持っていません。 還元剤も間違いなくワークしており、IgGを処理すると重鎖と軽鎖に完全に別れることも確認しています。 ご意見をいただきたいのは、SDSを加えてさらに還元剤まで加えてきちんと処理しているのにも関わらず、分子量よりもはるか上の（おそらくダイマーと思っていますが根拠はないです）バンドとして検出されるのはどういうことかについてです。 非常にわかりにくい記述かもしれませんが、ご教示いただけましたら幸いです。 どうぞよろしくお願いいたします。

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