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(無題) 削除/引用 No.1144-6 - 2012/11/13 (火) 20:52:38 - Harmonia ゲル切り出し前の酵素の失活処理はやったことがありません。 ですが、酵素処理したのだから、そのステップを終わらせるためには 失活処理をし、次の作業に移るべきだという主張は、間違いではない と思います。

(無題) 削除/引用 No.1144-5 - 2012/11/13 (火) 08:05:25 - mon AatIIだったかな、SDS等を添加しないとDNAに結合したままで泳動が乱れる酵素もあります。ですが皆さんと同じように、ほとんど場合Dyeを添加してそのまま泳動していますね。また酵素処理を阻害しないDyeもあるようですね。

(無題) 削除/引用 No.1144-4 - 2012/11/13 (火) 00:57:28 - おお 必要ないですふつうは。 partial digestionのような場合は止めないと行けないですが。売っているローディングバッファーによってはSDSが入っていて、酵素が活しそうなものもありますけど。 場合によっては制限酵素ようのバッファーの塩濃度が高いためえいどうが遅れる事はあると思います。どの程度正確な大きさを見たいかにもよりますが、そのまま流してもだいたいの大きさはわかりますので。気になるなら塩を抜くか薄めるかしないといけないと思いますが、時間などの無駄なだけの事もありますので、、、 熱による失活は2本鎖を解離させますので、もとに戻すのにまた時間がかかってしまいます。 通常出てくるマルチクローニングサイトを切るような酵素は、塩濃度で若干のシフトがあったとしても、失活処理または除去処理なしで全く問題ないですが、もし何かあまり使われない酵素で問題があったとしたならお話を聞かせていただければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1144-3 - 2012/11/12 (月) 23:14:45 - AP 必要無いです。ゲル抽出をするときは、フェノール抽出を省けるように手順を組むくらいで。ローディングバッファーには一般的にSDSやEDTAが入っていてい、酵素を止めてから泳動しますし。

(無題) 削除/引用 No.1144-2 - 2012/11/12 (月) 23:03:04 - ami そんなことはしていません。マニュアル通りでいいかと。

gel extraction前の制限酵素の失活処理の必要性 削除/引用 No.1144-1 - 2012/11/12 (月) 22:46:32 - K プラスミドDNAを制限酵素で切断し、キアゲンやインビトロジェンのgel　extraction kitを使って、目的バンドを切り出します。この場合、サンプルをゲルに流す前に、制限酵素を失活させるための熱処理やフェノール・クロロホルム処理は必要でしょうか？ メーカーの制限酵素の説明書きには「DNA精製用スピンカラム、またはフェノールクロロホルム抽出により酵素除去可能」とありますので、ゲルから切り出しをするなら失活処理は不要と思っていました。しかし、失活処理のプロセスを入れた方がいいという人もいます。キットを使ったゲル切り出しでは、酵素活性が残っていて、その後のライゲーション等に影響を及ぼすのでしょうか？

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