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(無題) 削除/引用 No.11429-8 - 2023/05/08 (月) 18:27:29 - G25 >BamH1の推奨バッファーは、かつてはTakaraにしてもBRLにしても大抵のメーカーはH buffer 相当 (Tris-HCl buff,NaCl 100 mM)で、ずっとそれでやってましたが、問題が起こったことないです。なので私ならNde1/BamH1二重消化にHを選ぶかもしれません。 いまでもNEBがまさにそうでした。BamH1 (HFバージョンなどでない従来品）の推奨バッファーはH相当(NEB 3.1)であり、Nde1との同時消化の推奨バッファーもそれ。 >NEBによれば、NdeIの切断効率と付加塩基数は6bpで0%、7bpで75% (2hr), >90% (20hr)。ただしこの数値はオリゴDNAの切断の場合。PCR産物は違うかもしれませんが。あと、これはNEBのデータなので他社は違うデータを持っているかもしれません。 そのリンク先のデータはPCR時代以前に、認識サイトの配列の両端に調べたい塩基数のヌクレオチドを付加したちょっと特殊な基質でしらべたものです（もうお蔵入りしていて、現行カタログのappendixからは削除されてますね）。PCR産物の末端により近い基質、すなわち十分に長いDNA(12 bp)の先に認識配列と1-5 bpの余剰のヌクレオチドを付加したもので調べたのがこのテーブル。 https://international.neb.com/tools-and-resources/usage-guidelines/cleavage-close-to-the-end-of-dna-fragments この資料だとほかの酵素と比べてNde1もそこまで切断効率が悪いわけではなさそな。ただし+++で50-100%なので実際には100%に程遠いのかもしれないけど。 Nde1は認識配列の後半がATGなので、開始コドンピタリで発現ベクターに組み込めるというので重宝されましたが、すくなくとも今ではそれほどメリットないんじゃないかな。 ・N末端にタグを付ける融合タンパク質の場合なら開始コドンにこだわる必要ないので、どうしても開始コドンでつなぎたいという場面は限られている。 ・今ではin-fusionなどligation independent cloningのシステムがいろいろあるので、わざわざ扱いづらい制限酵素で苦労して切り貼りすることもない。

(無題) 削除/引用 No.11429-7 - 2023/05/08 (月) 12:27:47 - 2ME 参考までに、NdeIに関するあれこれを。 1. ttps://international.neb.com/-/media/nebus/files/chart-image/cleavage_olignucleotides_old.pdf NEBによれば、NdeIの切断効率と付加塩基数は6bpで0%、7bpで75% (2hr), >90% (20hr)。ただしこの数値はオリゴDNAの切断の場合。PCR産物は違うかもしれませんが。あと、これはNEBのデータなので他社は違うデータを持っているかもしれません。 ただまあ、気になるようならNdeIを含むプライマーデザインを変えてもよいかもしれませんね。 2. ttps://international.neb.com/faqs/2011/12/22/ndei-seems-to-be-digesting-my-dna-correctly-but-when-i-try-to-ligate-it-i-obtain-no-colonies-is-t If the substrate DNA is digested for extended periods of time, we have found evidence that the enzyme will remove some additional nucleotides. Digestion of DNA with NdeI over 4 hrs is not recommended. 確か、AddgeneにもNdeIの長時間処理はよくない、みたいなことが書いてあったような…… NdeIは切れにくいくせに、長時間処理すると塩基が脱落するという、ちょっと厄介な酵素です。 3. ttps://www.microbiology.ubc.ca/sites/default/files/roles/drupal_ungrad/JEMI/7/7-68.pdf NdeI処理産物のライゲーション効率が悪いという報告。22時間以上のライゲーション処理ですこし善くなると書いてあります。なぜNdeIカット産物のライゲーション効率が低いかはわからない、とも書いてあります。 以上、参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.11429-6 - 2023/05/08 (月) 12:16:43 - G25 スター活性によって切断されるとエクストラバンド、ラダー、スメアが生じるのですぐわかります。それがなければ一応セーフと考えていいです。 BamH1の推奨バッファーは、かつてはTakaraにしてもBRLにしても大抵のメーカーはH buffer 相当 (Tris-HCl buff,NaCl 100 mM)で、ずっとそれでやってましたが、問題が起こったことないです。なので私ならNde1/BamH1二重消化にHを選ぶかもしれません。 Nde1は切れにくい酵素だと言われてますね。PCR産物の末端を切る場合、足場を長めにしなきゃだめとか（6 bpなら十分に長いと思いますが）。PCR産物末端消化の効率を評価したFermentasの資料だと、他の酵素は1時間消化で評価しているのに、Nde1だけは16時間消化したと注釈が付いているくらいなので、切れにくさがわかるというもの。 PCR産物末端が切れたか切れていないかを評価する方法は、それだけでligationしてみること。両端が切れていれば重合が無制限に起こりバンドが運と高分子側にシフトします。一方の酵素でしか切れていなければ二量体にしかならない。どっちも切れていない分子は単量体のまま。 そのようにしてチェックしてみると、経験上、PCR産物の末端消化の効率はあまり良くないです。大概、重合するのは2-3割くらいなもので、大部分が重合せず単量体で残っていることも。 PCRサイクルを回しすぎると良くないように思います。プライマーからの新規合成で二重鎖になる文には良いけど、回しすぎてPCR産物の解離、再対合が繰り返されはじめると、末端が制限酵素の基質となるきれいな二重鎖になってないんじゃないかと想像します。 プラスミドの二重消化ができているかどうか疑問がある場合、同時消化ではなく順次消化することをおすすめします。先に切れにくいほう、この場合Nde1で切って完全消化されているのを確認してから、楽勝のほう、BamH1で切ればいいです。 認識サイトが隣接している場合は、順番によって切れる切れないが決まっていいる場合がありますが、一般にcccに対しては制限酵素は効きにくいもので、直鎖状になるとどの酵素でも普通に切れるようになります。 切れにくいNde1で先に確実にone-cutしとけば、あとのBamH1で切れてないという心配は殆どありません。

(無題) 削除/引用 No.11429-4 - 2023/05/08 (月) 10:22:13 - おお >[Re:3] 0507さんは書きました : > おお様、回答ありがとうございます。 > > > インサートのほうの末端はNdeIで切れているのでしょうか？PCRフラグメントならそちらの方が気になります。 > > PCRでoverhangを6bp取り、制限酵素処理していますが、実際に切れているかどうかは不明です。何か確認できる方法はありますか？ やるかどうかはおいといて、無くはないです。pcr産物をリン酸化、あるいはプライマーをリン酸化して、PCRしライゲーションでPCR産物同士で繋ぐ。そのあとNdeIで切ることにによりサイズの変化を見る。 > > また、タカラのダブルダイジェスチョンのカタログでは、Nde1とBamH1ではKバッファーを使用すると書かれていますが、Nde1単品のカタログを見ると、Kバッファーではスター活性が現れやすいとなっていることも気になっています。 なら、なおさら前述のようにNdeIで切って、そのあと簡単な精製をかまして、Bamできればいい。

(無題) 削除/引用 No.11429-3 - 2023/05/07 (日) 21:06:02 - 0507 おお様、回答ありがとうございます。 > インサートのほうの末端はNdeIで切れているのでしょうか？PCRフラグメントならそちらの方が気になります。 PCRでoverhangを6bp取り、制限酵素処理していますが、実際に切れているかどうかは不明です。何か確認できる方法はありますか？ また、タカラのダブルダイジェスチョンのカタログでは、Nde1とBamH1ではKバッファーを使用すると書かれていますが、Nde1単品のカタログを見ると、Kバッファーではスター活性が現れやすいとなっていることも気になっています。

(無題) 削除/引用 No.11429-2 - 2023/05/07 (日) 19:42:59 - おお NdeIは純度の低いDnaを切断するとき切れにくいことがあるような記述を見たことがあります。 ベクター側はNdeIで切断して、切れるかどうか 確認してから次にBamで切ると無難だと思います。一部切れてない場合でも、切れたバンドだけ切り出すことも可能ですから。 また、間接的にNdeIで切れたかどうか評価するなら、Bam NdeIで切った後 脱リン酸化しないで、ゲル切り出しをして、ライゲーション+/-で形質転換効率を見てもわかると思います。わざわざそこまでやるかはおいといて、 インサートのほうの末端はNdeIで切れているのでしょうか？PCRフラグメントならそちらの方が気になります。 NdeI側はフレームを合わせないといけないとかないなら、まずベクターはBamで切って、フラグメントとライゲーションさせたのち、ブラントエンド処理をしてからもう一度ライゲーションして形質転換という手も取れます。インサートがNdeIで切ってないPCRフラグメントとかプラスミドからNdeIより外側で切っていたなら、この方法でできたプラスミドをNdeIで切れば酵素が働くなら余分なぶぶんを切り出せます。

Nde1は切れにくい? 削除/引用 No.11429-1 - 2023/05/07 (日) 17:59:00 - 0507 こんにちは。現在、私は大腸菌異種発現系に使用するベクターを制限酵素を用いて、その構築を行なっております。 制限酵素は、Nde1とBamH1を使用しています。ベクターおよびインサートの制限酵素処理に使用したバッファーは、タカラバイオのカタログに従い、1×Kです。制限酵素処理後、ゲル抽出や脱リン酸化(ベクターのみ)を行ない、ライゲーションを行なったところ、形質転換体を得ることができませんでした。 そこで、ライゲーション反応により、アガロースゲル電気泳動上のバンドがどのように変化するか評価しました。すると、ライゲーションにより、制限酵素により切断されたインサートおよびベクター由来と思われるバンドに加えて、2本のバンドが現れました。うち一方は高分子側にあり切断ベクターより上流に位置し、切断ベクターのバンドに近接(約500 ~ 1000 bpの違い) していたので、ゲル抽出はできませんでした。もう一方(切断ベクターとインサートの中間ぐらい) をゲル抽出してみて、Nde1、BamH1のそれぞれで反応させたところ、Nde1では全くバンドの位置が変わりませんでしたが、BamH1では切断されインサートのバンドの位置と一致しました。 以上の結果より、何かしらの影響でNde1側の突出末端が正常に形成されず、BamH1のみで切れたベクターおよびインサートができたので、ライゲーションを行なったことで、インサート-インサートおよびベクター-インサートの直鎖状DNAが生成させたと結論付けました。形質転換体が得られなかった理由として、Nde1の切断不良と考えており、HPで調べるとNde1は切れずらいという意見が散見されますが、実際のところいかがでしょうか。また、この問題を改善するためには、どのような方法を取るべくでしょうか。 長文になってしまい申し訳ございませんが、ご意見いただけますと幸いです。

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