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(無題) 削除/引用 No.11425-12 - 2023/05/03 (水) 06:21:40 - 774 シークエンスが正しいor間違って（読めない場合も）たら、それぞれどのように解釈されますか？ 制限酵素処理をやらないのは何か理由はありますか？ 決して非難するつもりはなく、個人的に知りたいだけなのですが、 不愉快に思われたら申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.11425-11 - 2023/05/02 (火) 18:46:27 - あむ 明日フルレングスのシークエンスに提出しますので、また経過を報告したいと思います。 繰り返しになりますが、1塩基の違う配列のプラスミドを比較していて、初回抽出時は、全く泳動距離は一緒でした。

(無題) 削除/引用 No.11425-10 - 2023/05/02 (火) 17:34:10 - G25 たまにカテナンだかコンカテマーだか作りやすいプラスミド/宿主があったりして、 ちょっとした培養条件（培養時間が長いとか？）の違いか何か知らないけど、 オリゴマーがやたら多いということもなきにしもあらず。 モノマーが全然なくなってオリゴマーだけになるというのはなかったけど。

(無題) 削除/引用 No.11425-9 - 2023/05/02 (火) 11:01:21 - あむ ありがとうございます。 さらに追加実験をしたところ、 一回目の抽出は問題なし。 二と三回目で同じ傾向が見られることが分かりました。 2回目と3回目は同じクローン由来で、1回目はだいぶ前なので、同じだったか記憶が曖昧です。安心しきっていたので、細かくメモを取っていないです。シングルクローンを取ったつもりが、2クローンを培養していた可能性もあるかもしれません。 大腸菌でニックが入りやすい配列とか存在しないですよね？？

(無題) 削除/引用 No.11425-8 - 2023/05/02 (火) 10:20:06 - G25 nickが入ってOCになった説が有力だと思います。cccとOCではちょうど移動度が二倍くらい違います。 「3つのうち一つだけnickが入るのは考えづらいからその可能性は低い」とは思いません。 OCかどうかは制限酵素で一箇所切って泳動してみればすぐわかるでしょ。シークエンスする前にまずやるべきことだと思います。ほかの２つのプラスミドと同じサイズになるんじゃないかな。 プラスミドが二分子分、連結された二量体であるという可能性も無きにしもあらず。one-cutしたら単量体と同じバンドになるので区別つきません。しかし、移動度は線形DNAのサイズマーカーで比較すると二倍までにはならなi\いはず（cccではサイズが大きくなった時の移動度の低下は線形DNAより小さい,バンド間隔が狭い）。 二量体でもカテナンだと移動度はOCなみに小さくなると思いますけど。 そのプラスミドで再び大腸菌を形質転換し、プラスミドを精製してみてください（これもシークエンスより前にすぐにでも試すことだと思う）。それで泳動してみて単量体の移動度であれば、nickingしてOCになったものを見ていたということになります。それでもサイズが大きくでるなら、実際に二量体（コンカテマーあるいはカテナン）なのかもしれない。 ちなみにnickが入っていても宿主細胞内で修復されるので遺伝子発現は起こるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.11425-5 - 2023/05/02 (火) 08:22:38 - おお わたしはUncutのサイズは信用しませんね。 だいたいサイズに沿って移動するとは言われていますけど、それでも正確なサイズはわからないですし、個人的な経験としてなんだか全体的にすめあーになるプラスミドも経験しています。また、Closed, relax circularのプラスミドにGyraseを作用してスーパーコイルを作ろうとすると、泳動パターンはラダーになるので、巻き方が違うと違うサイズに来ることもあります。Plasmid Concatemerというのも形成されるそうで、そうなるとサイズが倍ぐらいになってもおかしくない。 ですから、１カットあるいはインサートを切り出す、あるいはインサートない一か所とプラスミドない一か所などでサイズを正確に把握することが大事だと思ってます。 もう一つの可能性はまれに大腸菌からの精製時にNaOHでDNA（主にゲノム）を変性させる際に行き過ぎてプラスミドも可逆的な変性状態になることがあるようです。この場合は制限酵素で処理するのも難しくて何をしても変な位置に変な形のバンドが見れることがあります。この場合は形質転換しなおすしかないです。

(無題) 削除/引用 No.11425-4 - 2023/05/02 (火) 07:58:20 - momo ダイマーを選んでしまったんじゃないでしょうか。制限酵素の切断パターンに変化が無いかどうかを確認してみてはどうですか？

(無題) 削除/引用 No.11425-3 - 2023/05/02 (火) 03:36:37 - あむ uncutでニックのチェックをしている時に明らかにバンドが高い位置にあるのが確認できました。 最近、新しく調整しなおしたんですが、、、nickの可能性もありますかね。にしても、他の1塩基だけ異なる他の3サンプルは同じ位置で、そのプラスミドだけニックが入りやすいというのはちょっと考えづらいんですが、、、、 何度かプラスミドをコロニーからピックアップしているんですよね。

(無題) 削除/引用 No.11425-2 - 2023/05/02 (火) 03:09:21 - おお ＞今までデータを蓄積していたのですが、哺乳類に入れて同じタンパク質だけが発現しているのであれば、過去のデータは、それはそれで信頼できると考えて問題ないのでしょうか。 それは配列を読んでから結論を出したほうがよさそうです。 で、２倍になったと思われるのは形質転換して増やしなおしたクローンですか？昔使ってたTubeの溶液のプラスミドがいきなり２倍の大きさになるのは皆無だと思いますが。制限酵素処理せず電気泳動するとニックが入っていた場合非常に大きいサイズのところ（実際のサイズではなく）にきます。それならプラスミドが劣化（ニックがはいった）なのかもしれません。そういうのであればそのプラスミドで発現していれば発現したたんぱくの効果は見れていると思います。 その２倍になったのはインサートサイズですか？１カットのサイズですか？

プラスミドの異変 削除/引用 No.11425-1 - 2023/05/02 (火) 02:39:34 - あむ 哺乳類の培養細胞でプラスミドを一過性発現させて解析しています。 いつの間にか使用している、プラスミドの全長が2倍？になっていることに気づきました。 どこで何が起きたのかわからないので、今フルレングスでシークエンスを読んでいる最中です。 GFP付きで、発現している箇所も発現量も同じなので気が付きませんでした。 今までデータを蓄積していたのですが、哺乳類に入れて同じタンパク質だけが発現しているのであれば、過去のデータは、それはそれで信頼できると考えて問題ないのでしょうか。

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