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(無題) 削除/引用 No.11424-18 - 2023/05/03 (水) 09:49:49 - Tracker へたりも含めて、ポリクロ抗体の質が変わっちゃってるかもですね。

(無題) 削除/引用 No.11424-17 - 2023/05/03 (水) 07:25:31 - lipid 2ME様 色々推察頂き、ありごとう御座います。 スプライシング異常によるtruncated formの生成は、 可能性は少ないものの、ORFの精査で比較的コスパも良く確認できるので、 検討してみたいと思います。 抗体は、ポリクロです。 LPS様 先週、分譲時に近い細胞株を起こしています。 連休明けに，これについては検討予定です。 検出出来ていた時の状態を可能な範囲で再現する事で、 解決への糸口を，更に明確に整理できたらと思っています。 皆様方より多数ご意見頂けて、 とても参考になります。

(無題) 削除/引用 No.11424-16 - 2023/05/03 (水) 02:32:29 - LPS 細胞が感染している可能性も排除できないのでは。なんらかの刺激が入っているのかも。 別のストック、細胞の新規購入も考えてみては。

(無題) 削除/引用 No.11424-14 - 2023/05/02 (火) 17:05:43 - 2ME >[Re:11] lipidさんは書きました : > 細胞はHepG2で、stableでもtransient系でもありません。 全体的にサンプル調製からウェスタンまでのどこかが疑われているようですが――私も真っ先にそこを疑います。プロテアーゼインヒビターカクテルのへたりとか、サンプルバッファー添加のボイルを疑いますが――他の可能性も念のため考えました。 stableやtransientであればプラスミドの異常を疑いましたが、そうではないということで除外します。 Hep2Gの当該遺伝子のゲノム上の変異も疑いましたが、シングルセルをクローニングして使っているのでもない限り、特定の変異が細胞集団のマジョリティーになることは考えにくいので、これも一応除外します。 あと、疑わしいのはその細胞におけるMTTP遺伝子のスプライシング異常です。truncated formとして翻訳されているのではと。蓋然性は低いですが。たとえば、RT-PCRでORFをシーケンスして確認してはいかがでしょうか。確認にはさほど費用はかからないと思います。 それと、もしモノクローナル抗体を使っており、かつ、エピトープが既知ならば、そこからある程度の見当は付きませんか。

(無題) 削除/引用 No.11424-13 - 2023/05/02 (火) 16:51:52 - lipid あああ様 確かに、ごもっともです。 100ｋDaとしたらおおよそ2400塩基なので、クローニングして材料として持っておくのも１つですね。

(無題) 削除/引用 No.11424-12 - 2023/05/02 (火) 16:35:34 - あああ そのたんぱく質の発現ベクター（可能であればタグ付き）をトランスfエクションして、97kDaに出るか35kDaに出るかを試してみれるのはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11424-11 - 2023/05/02 (火) 16:29:24 - lipid ２ME様 細胞はHepG2で、stableでもtransient系でもありません。 抗体のデータシートでも良く使用される、細胞株になります。

(無題) 削除/引用 No.11424-10 - 2023/05/02 (火) 15:35:10 - 2ME 細胞は何かの細胞株ですか。それとも外来遺伝子発現系（安定発現系、一過性発現系）ですか。

(無題) 削除/引用 No.11424-9 - 2023/05/02 (火) 12:37:51 - lipid おお様 97が検出出来ていた時は、35ｋDaは検出されていません。 ただ、正確に言えば、９７が検出された時はオーバーエクスポーズしておらず、もしかしたら過剰露出していれば検出できた可能性は否定できません。 通常の測定範囲内では97ｋDaのシングルバンドのみで、 非特異バンドは一切見られていません。 バックも極めてきれいです。 現在ゲルは購入しており部屋で作成は行っていませんが、 既製品でも劣化の可能性はありますね。 一応、購入速やかに泳動−転写−染色を行っても、変わりが無かったです。 ＞最近の技術ではLysateからでも確実に同定できるのでしょうか 方法論はいくつかあるかと思いますが、可能だと思います。 手間と効率、必要性の高さで、手順は変わってくるように思います。

(無題) 削除/引用 No.11424-8 - 2023/05/02 (火) 10:18:11 - おお 97が検出できていた時に35ｋDaは検出されてましたか？ 疎水性の強いタンパクなど、まれにボイルであぐってしまって予想以上に大きな分子量になることはあります。わたしはそういうのをさけるために５０度ぐらいでサンプルバッファー処理をしています。 ゲルの劣化も原因となることがあります。Tris-GlycineのゲルはｐH８．８と高く、これがゲルの劣化を促進しているようです。アルカリ側ではポリアクリルアミドは劣化しやすいらしいです。ラボで作って流していますが、作り置きが２週間ぐらいたつと徐々に高分子のほうから分解能が落ちてきます。 因みにどれくらいのタンパク濃度のLysatesを調製して、どれくらいを流していますか？ ＞1/3程度の小ささでしたので、質量分析に踏み入れるのは躊躇していました。 検討考えてみます。 少なくともIPしてその部分を切り出ししないとほかのタンパクで埋もれて何を見ているかわからなくなりそうですが、最近の技術ではLysateからでも確実に同定できるのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.11424-7 - 2023/05/02 (火) 06:29:11 - lipid あの様 操作は全く同じです。 室温でも氷冷下でもなく、オンアイスでの急冷です。 なかなか原因が分からず、本タンパクだけに見られる現象となっており、 対応が難しい状態です。

(無題) 削除/引用 No.11424-6 - 2023/05/01 (月) 21:32:48 - あの 97のときと、35のときで、完全に操作が同じですか？ 当方の次の話が参考になれば幸いです。 以前、膜タンパク(GPCR)のウェスタンブロットをやっていて、 実験者によるバンドサイズの差が出たので、よくよく検討したら。 SDS処理でボイルした後に、室温で冷ますか、オンアイスで一気に冷やすかの 違いが原因だったことがありました。 そのときは、室温で冷ますと、バンドサイズは小さくなりました。

(無題) 削除/引用 No.11424-5 - 2023/05/01 (月) 18:05:40 - lipid wb様 それぞれそれとも独立した実験として別々に用意したものです。 確かに、従前検出出来ていたサンプルを、 再度泳動、染色する事は憲章にはかなり重要な所ですが、 極めて残念ながら97ｋDaが検出されていたサンプルが手元になく、 検討できない状態です。。。。 あい様 1/3程度の小ささでしたので、質量分析に踏み入れるのは躊躇していました。 検討考えてみます。 この断片が、目的のタンパクの断片であるかは重要かもですね。

(無題) 削除/引用 No.11424-4 - 2023/05/01 (月) 17:54:09 - wb 97KDaが検出されたときと35KDaが検出された時の検体は同じものですか（凍結保存しておいて再利用とか）。それとも、それぞれそれとも独立した実験として別々に用意したものですか。 後者の場合、たとえばもともとの97KDaのシグナルが出ていたサンプルを再度泳動してImmunoblottingしたらどうなりますか。

(無題) 削除/引用 No.11424-3 - 2023/05/01 (月) 17:52:11 - あい すいません。ゲル切り出しだと質量分析することになりますね。

(無題) 削除/引用 No.11424-2 - 2023/05/01 (月) 17:49:16 - あい 直接的な解答でなく申し訳ないのですが、所属機関に設備があればゲルを切り出してプロテインシーケンサーで目的のタンパク質なのか確認するのはいかがでしょうか。

ウエスタンでの分子量の大きな違い 削除/引用 No.11424-1 - 2023/05/01 (月) 17:41:56 - lipid ミクロソームトリグリセリド転送タンパク（MTTP）に対するウエスタンの検出を行っています。 このタンパクは、97ｋDa程の大きさで、これまでかなり強いシグナルで単一バンドで検出出来ていました。 あり実験を境に、97→35ｋDa程の分子量でしか検出できなくなりました。 サンプルの調整方法は全く同じであり、使用する細胞や培養条件も同一です。 このような現象が生じる原因、理由として考えられることは何でしょうか？ 抗体の劣化を排除するために、新規に購入して評価しても、やはり小さい分子量のみでした。 また、GAPDHはじめとする他のたんぱく質は適切に検出可能です。

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