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Stableで有意差が出たときの解釈 トピック削除
No.11418-TOPIC - 2023/04/30 (日) 07:25:25 - kt
Stable cell lineの比較解析を行っていますが、解釈に難渋しています。

Stable cell lineはラボで代々受け継がれているもので、当然ながら作成する際には、1-2か月の時間を要したと聞いています。

これらのcell lineを使って出てきた有意な違いはどこまで信頼できるものなのでしょうか。
 
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(無題) 削除/引用
No.11418-12 - 2023/05/01 (月) 21:45:27 - G25
trasfectonからの random integrationでできた”stable “ lineだと、導入遺伝子がランダム、多コピー、tandemに挿入して、シングルセルからクローニングしなければコピー数がヘテロジナスだし、反復配列であるがゆえにクローニングしても継代しているうちにコピー数がヘテロジナスになったり(反復配列が組換えを起こしてコピー数が増減)、RNAiやエピジェネティックな修飾の影響で発現が変わったりする可能性はあるでしょう。

(無題) 削除/引用
No.11418-11 - 2023/05/01 (月) 14:26:12 - G25
一個のストックから最初に大量に増やして同じロットの凍結ストックを多数作っておく。
一連の実験は同じロットのストックを使い、実験を始めるときは都度ストックから起こし、あらかじめ決めたパッセージ数を越えて実験に使用しない。
というくらいの配慮をすることは普通だと認識しています。

ちょっと質問のポイントがよく掴めないのですが、
「これらのcell lineを使って出てきた有意な違い」とは何と何を比べて有意な違いなんですか? 起こしたての細胞と2. 3ヶ月継代した後の細胞との比較で、というように読めますけど、

(無題) 削除/引用
No.11418-10 - 2023/05/01 (月) 14:12:31 - 2ME
>[Re:5] ktさんは書きました :
> 1−2か月の継代の段階で、細胞の性質が変わってしまうとそもそも、何を見ているかわからなくなるのではということを言いたかったです。

言いたいことはわかります。そして「何を見ているかわからなくな」らないように、裏を取る仕事をするわけですからね。

> 実験ってどこまで細かく追求するかで大きく仕事量が変わりますよね。

だと思いますよ。
まあ私は実験が楽しいと思うほうなので実験量が多いことは苦になりませんが、お金がかかるのは難点です。

(無題) 削除/引用
No.11418-9 - 2023/05/01 (月) 13:40:59 - TS
> 強制発現云々の話ではなくて、1−2か月の継代の段階で、細胞の性質が変わってしまうと

継代、凍結を繰り返してれば、遺伝子レベルで小さな差は出てくるのではと想像します(それが性質の差にもつながりうる)。モノクローンを取っていれば、複数のクローンで同じ傾向があれば信頼性が高いとは思いますし、他のかたもおっしゃっているように、一過性発現やサイレンシングなどの手法も組み合わせないと、結論するのは怖いかなと思います。

(無題) 削除/引用
No.11418-8 - 2023/05/01 (月) 13:28:21 - あああ
そのstable cell lineを比較するとそうなるということなのでしょうから、心配なら、心配が無くなるまで別の方法に変えて追加で実験するしかありません。
一過的に発現させる、ノックダウン、CrisprでKOするとか、別の方法で同じ傾向がみられればいいのだと思います。

(無題) 削除/引用
No.11418-7 - 2023/04/30 (日) 19:58:33 - おお
>[Re:5] ktさんは書きました :
> すいません。
> 強制発現云々の話ではなくて、1−2か月の継代の段階で、細胞の性質が変わってしまうと

なんらかは変わっているでしょうね。

>そもそも、何を見ているかわからなくなるのではということを言いたかったです。

そうともかぎりませんよ。

> stableはラボでストックされているもので、これは間違いがないものとして、進めても問題ないですかね。

それぞれの研究においてそうであるかよく考えて決めるのが研究者の仕事です。そもそもラボでストックされていると言うことなら、その細胞で実験したデーターもあり、発現させたタンパクの影響をみた実験もしているのでは?ならばそのデーターから今回のあなたの実験に適しているかの判断材料にもなるはずです。
また、安定導入株を使った論文はよく見かけられます。それらの論文は安定導入株だから何をみているかわからず、意味がない実験なのですか?
仮に、じゃあ一過性でやりますか?一過性発現にもデメリットがあり、そのデメリットだけを見て何を見ているかわからないとも指摘ができるわけで、そんなこんなで実験出来る系はないと結論出したりしませんよね。

>
> "その時点の真実"が科学の普遍的な真実とは限らないですよね。

それはどんな実験でもそう言う可能性を持っている。だから論文でも結果について書くときは示した実験においてを重点的に書く。その結果をもとにした普遍性について触れるときはdiscussion という形になるし、その中で矛盾しているでーたーが発表せれているならば、その解釈を書き加えなければならないし、自身の解釈がどの程度他の発表されたデーターと相補的かなどを議論を展開するのが普通でしょう。

(無題) 削除/引用
No.11418-6 - 2023/04/30 (日) 15:12:44 - 独り言
経験的には、1,2か月の培養で大きな形質が変化することはないでしょう(無限に増殖する培養細胞であれば)。実験は、継代数が少ないときでも、数か月培養したあとでも同じ結果がでるよう再現性を確認すれば、または、ちゃんとしたコントロールと比較していれば、継代の長さは影響しないと言える。



どれくらいの長さが影響するかしないかは、実験による。特殊な細胞の分化能だったら1,2か月で変化するかもしれないし、普遍的な細胞の機能であれば、半年なんて余裕だし。

(無題) 削除/引用
No.11418-5 - 2023/04/30 (日) 13:41:37 - kt
すいません。
強制発現云々の話ではなくて、1−2か月の継代の段階で、細胞の性質が変わってしまうとそもそも、何を見ているかわからなくなるのではということを言いたかったです。



実験ってどこまで細かく追求するかで大きく仕事量が変わりますよね。stableはラボでストックされているもので、これは間違いがないものとして、進めても問題ないですかね。

"その時点の真実"が科学の普遍的な真実とは限らないですよね。

(無題) 削除/引用
No.11418-4 - 2023/04/30 (日) 13:08:48 - 3456
発現レベルは内在性の生理的なレベルとは多分違うと思うし、本来の当該遺伝子とは発現の制御のされかたもちがうので、そういう前提のもとで、解釈するしかないとおもいます。つまり、こういう条件のこういうものを使ったらこういう結果になりました(違う条件でも同じかどうかまでは保証しませんし、本来の(内在性の)当該タンパクの機能や動態、特性を正確に反映しているかどうかは現段階では保留します。)、ということで。
それはそれでひとつの新知見なのでいいとおもいます。
ただその辺の限界を十分に考慮したうえでDiscussionを書けばよいかと。

(無題) 削除/引用
No.11418-3 - 2023/04/30 (日) 11:29:55 - おお
どう適しているかを完璧に言い当てれるケースも多いです。
–> どう適しているかを完璧に言い当てれないケースも多いです。

(無題) 削除/引用
No.11418-2 - 2023/04/30 (日) 11:28:48 - おお
それぞれの実験には、それぞれの特徴がありそれに適してない実験もあれば、逆の場合もあります。その上、どう適しているかを完璧に言い当てれるケースも多いです。大抵そうです。この場合その実験が自身の仮説をどの程度明らかにしているかしめすために、色々な観点から実験をしていくのが普通です。そう言うアプローチは論文を読んでみるとわかるはずです。普通安定導入株で実験したデータの図一つで論文になっていません。

Stableで有意差が出たときの解釈 削除/引用
No.11418-1 - 2023/04/30 (日) 07:25:25 - kt
Stable cell lineの比較解析を行っていますが、解釈に難渋しています。

Stable cell lineはラボで代々受け継がれているもので、当然ながら作成する際には、1-2か月の時間を要したと聞いています。

これらのcell lineを使って出てきた有意な違いはどこまで信頼できるものなのでしょうか。

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